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肿瘤细胞耐药是临床上复发性和难治性白血病化疗失败的主要原因之一，经典的多药耐药(multidrugresistance，MDR)机制并不能完全解释肿瘤细胞的耐药现象及彻底逆转耐药性。因此，深入研究白血病细胞的耐药发生机制并探讨逆转策略极其重要。
细胞周期检测点信号通路是细胞的一种自我保护机制。50％以上的肿瘤细胞因p53基因功能缺陷致使G1/S期检测点的阻滞作用缺失，当细胞受到放化疗损伤后，绝大部分停滞在G2/M期，修复受损的DNA，从而提高肿瘤细胞的抗损伤能力而导致肿瘤的耐药。
细胞周期检测点激酶1(checkpointkinase1，Chk1)是G2/M检测点活化的重要效应分子，能直接参与调控DNA损伤修复和细胞凋亡，在维护基因组稳定性方面具有较强作用。Chk1的高表达及酶活性升高是导致肿瘤细胞增殖活性和抗凋亡能力增强的重要原因；抑制Chk1表达则增加了诸多化疗药物(如Topo抑制剂、抗代谢类药物、抗微管类药物等)的细胞毒效应。可以推断，Chk1信号通路是影响肿瘤细胞对化疗药物敏感性的关键因素。但在以P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)介导耐药为主的细胞中，Chk1信号通路是否也发挥同样作用尚不清楚。因此，本课题以人红白血病耐药细胞株K562/A02(耐阿霉素)为研究对象，探讨Chk1对白血病细胞耐药的调控机制；随后应用RNA干扰技术沉默Chk1基因，观察Chk1在白血病细胞耐药中的作用；并进一步研究联合阻断Chk1信号通路与P-gp泵功能两条途径对逆转K562/A02细胞耐药性的作用，为临床上克服白血病细胞化疗耐药提供更为有效的作用靶点及治疗途径。
第一部分Chk1引起的G2/M期阻滞在K562/A02细胞耐药机制中的研究
目的：研究Chk1对白血病细胞周期分布的影响，探讨Chk1调控肿瘤细胞耐药的机制。
方法：以人红白血病细胞系K562及其耐药细胞株为K562/A02研究对象，与阿霉素共同孵育后，流式细胞术检测细胞周期分布，RT-PCR检测Chk1mRNA表达水平，Western-blot检测其蛋白质及磷酸化水平的表达。
结果：阿霉素致K562/A02细胞阻滞在G2/M期的细胞百分率为(54.12±0.57)％，显著高于K562细胞的(36.99±1.28)％；Chk1mRNA及蛋白表达水平在K562与K562/A02细胞间无显著差异；Chk1磷酸化水平在K562/A02细胞为0.79±0.56，K562细胞为0.27±1.47，其差异有显著性意义。
结论：G2/M期阻滞是导致白血病细胞耐药的机制之一，Chk1磷酸化水平与G2/M期阻滞密切相关，提示Chk1的活化状态参与调控白血病细胞耐药的形成。
第二部分Chk1基因沉默增强K562/A02细胞对阿霉素敏感性的实验研究
目的：研究Chk1基因沉默对K562/A02细胞生长的影响，探讨Chk1在白血病细胞耐药中的作用。
方法：通过电穿孔转染法将特异性靶向Chk1的短发卡状RNA(shorthairpinRNA，shRNA)导入K562/A02细胞，应用RT-PCR、Western-blot检测细胞内Chk1的表达，流式细胞术(FCM)检测其细胞周期分布及细胞的凋亡率，MTT法测细胞的增殖。
结果：与对照组和空载体转染组相比，shRNA使细胞中Chk1mRNA水平下降了66％，蛋白水平下降了60％。抑制Chk1的表达可解除阿霉素引起的G2/M期阻滞；使阿霉素诱导的细胞凋亡率由转染前的(5.67±0.78)％上升到(19.25±1.41)％；在阿霉素浓度0.4mg/L、4mg/L时，细胞的增殖活性分别下降12％、20％。
结论：靶向Chk1的shRNA能有效下调Chk1的基因表达，继而解除阿霉素诱导的G2/M阻滞，促进细胞凋亡及增强K562/A02细胞对阿霉素的敏感性，提示抑制Chk1表达是逆转白血病细胞化疗耐药的靶点之一。
第三部分Chk1shRNA联合环胞素A逆转K562/A02细胞耐药的实验研究
目的：研究联合阻断Chk1信号通路与P-gp泵功能两条途径对逆转K562/A02细胞耐药性的作用，探索有效的克服白血病细胞耐药的策略。
方法：MTT法测定CsA的非细胞毒性剂量；Chk1shRNA与CsA联用后，MTT法检测细胞的药物敏感性；流式细胞术检测细胞凋亡、细胞周期及细胞内阿霉素浓度的变化。
结果：CsA浓度低于2.95±0.39mg/L时对K562/A02细胞的生长抑制率小于10％。Chk1shRNA联合CsA(1mg/L)使阿霉素对K562/A02细胞的IC50值由原来的109.65±0.26mg/L降至2.44±0.51mg/L，逆转倍数为45倍，明显增加了细胞敏感性；细胞凋亡率升至(66.74±1.62)％，与Chk1shRNA或CsA单独处理组相比有显著差异。Chk1shRNA与CsA单独或联用均导致G2/M期细胞百分率显著下降，分别为(17.10±0.63)％、(14.60±0.97)％、(18.21±1.13)％，三者间无显著差异，但联用组有明显的亚G1峰。Chk1shRNA联合CsA组细胞内阿霉素浓度为(22.06±0.56)，与CsA处理组(20.44±0.79)相比，其差异无显著性意义。
结论：Chk1基因的表达下调与P-gp泵功能的抑制两个靶点的联合能够更有效逆转白血病细胞的耐药。