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第一部分 Kv2.1在甲基苯丙胺引起海马神经元损伤中的作用甲基苯丙胺(Meth)是一类非法的精神兴奋剂,其滥用已成为全球性的公共卫生难题。Meth可引起中枢神经系统退行性改变,其中,细胞凋亡引起的神经元丢失是重要机制之一。外向延迟整流型钾通道亚型Kv2.1激活或高表达可引起钾离子持续外流,细胞皱缩,最终诱导凋亡。因此,本实验以钾离子通道亚型Kv2.1为研究靶点,探讨其在Meth作用下,与海马神经元损伤间的关系。实验室前期结果表明Meth可引起外向钾电流的增加,在此基础上,通过western blot的方法我们发现,Meth引起Kv2.1蛋白表达量呈时间及剂量依赖性的增多,并伴随细胞凋亡水平升高。而利用Kv2.1特异性抑制剂GxTX-1E与海马神经元共孵后,发现GxTX-1E能有效抑制Meth引起的细胞凋亡。借助于慢病毒感染海马神经元的方法,使Kv2.1高表达,结果显示,Kv2.1转染组较正常细胞组或空载体组,凋亡水平明显升高(cleavedcaspase3表达升高,bcl-2减少),进一步提示Kv2.1可能是Meth促凋亡作用中的重要靶点。第二部分MAPK参与甲基苯丙胺引起的海马神经元损伤丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase,MAPK)参与调节细胞活化、分化、增殖、生存及细胞因子产生等多种细胞活动,亦可介导细胞凋亡过程。Meth入胞后,MAPK通路广泛激活,参与不同的生理、病理调节过程。本实验探讨了 MAPK通路参与Meth引起海马神经元损伤中的作用。Western blot结果显示ERK1/2、JNK、p38MAPK通路均可被Meth磷酸化激活,而分别加入三者特异性的抑制剂预孵后,仅p38MAPK抑制剂(SB203580)可显著下调细胞凋亡水平(JNK通路抑制后可在一定程度下降低cleaved-caspase 3表达),同时p38抑制剂及JNK抑制剂(SP600125)均能降低Meth诱导的Kv2.1的表达。以上结果提示Meth可能通过磷酸化激活p38 MAPK通路对Kv2.1钾通道进行调控从而介导海马神经元的损伤。第三部分Sigma-1受体在甲基苯丙胺引起的海马神经元损伤中的作用Sigma-1受体广泛存在于中枢神经系统中,被视为多种神经退行性病变的潜在治疗靶点。其作为特异性精神类药物结合蛋白,是Meth在胞内的重要受体之一,其突出特点还在于,该受体能够调节多种离子通道功能。鉴于sigma-1受体的配体能可逆性的抑制延迟整流型钾通道,同时结合钾通道主要亚型Kv2.1可能作为Meth作用下细胞早凋的重要靶点这一结果,本部分内容利用western blot的方法,通过细胞膜蛋白提取技术,探讨在Meth引起的细胞凋亡过程中,sigma-1受体激动剂与抑制剂对Kv2.1表达与分布的影响及相关信号转导通路。本部分实验中,我们发现sigma-1受体表达随Meth浓度的增大而升高。sigma-1受体激动剂PRE-084能抑制Meth诱导的细胞凋亡作用,而sigma-1受体抑制剂BD-1063对细胞凋亡未有明显影响。同时,sigma-1受体的激动剂PRE-084可下调Kv2.1蛋白的表达,抑制通道蛋白的膜迁移,并降低p38MAPK通路的磷酸化水平,该现象可为sigma-1受体激动剂抑制细胞凋亡的作用提供部分解释。