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研究背景干细胞的研究和应用是重大疾病再生性修复和治疗的新途径和新希望。目前关于干细胞的分离、鉴定、培养、扩增、保存、复苏等关键技术得到了各个研究机构及个人的高度关注,而BMSCs因其来源充足、可实现自体移植等优点倍受青睐。次声波是频率在0.0001～20Hz范围内的机械振动波,可能有机械效应、温热效应,及化学效应等生物学效应,次声对人体各系统均有影响,可引起体内细胞的生物学变化,还可对多种体外培养的细胞产生影响。次声在脑缺血再灌注损伤等神经系统疾病的防护上,有一定效应,还可影响神经前体细胞的增殖。而BMSCs也已经广泛用于神经系统疾病,其机制可能是通过在体内的神经分化实现的,所以开展次声对BMSCs的生物学效应研究就是一项非常有必要的课题。目前,国内学者多研究次声对成骨细胞、神经前体细胞、小角质细胞、角膜细胞、癌细胞等细胞的超微结构及增殖能力等方面的影响。对BMSCs的研究还鲜有报道,但是已有人做过低强度超声对BMSCs所产生的生物学效应的研究,发现低强度超声可以促进BMSCs的增殖及软骨定向分化,次声同样作为一种机械波,在这方面可能会有共通之处。国外方面：近年来,国外学者对次声在生物医学界的研究较少,多为次声对机体产生的损伤效应。在细胞培养方面,大多数人认为某些细胞因子及氨基酸对细胞的培养及分化有一定的作用,但也有人已经提出力学因素在这一方面的作用。次声波的生物学效应主要由频率、时间、强度等参数来决定,本课题主要观察低压级次声不同作用时间对BMSCs所产生的生物学效应。研究目的观察次声对骨髓间充质干细胞(Bone Marrow Stromal Stem Cells, BMSCs)的生物学效应,包括增殖、凋亡和周期分布,以及超微结构的影响,探讨次声合理应用的时间参数。材料与方法：1、细胞的培养和鉴定：用颈椎脱位法处死SD大鼠,分离获得股骨和胫骨,用DMEM/F12培养基反复冲洗骨髓腔,将冲洗后的骨髓悬液室温状态下离心1000r.p.m,5min。离心结束后,倒掉上清液,用含10%胎牛血清和90%DMEM/F12培养基的细胞全培液重悬细胞,在37℃、5%CO2孵箱中培养,2天后换液,之后每隔2天换液1次。在原代细胞充分融合后,用含0.02%EDTA的25%的胰酶和PBS液(1：1)消化细胞后,传代纯化细胞,所有实验都采用p3代细胞,采用流式细胞术检测间充质干细胞的表面抗原标志CD29, CD90和CD45的表达情况,用台盼蓝检测细胞活力。2、试验方法：取P3代细胞分为：实验组(次声处理10min,30min,60min)和对照组(空气暴露相同时间),细胞处理结束后,迅速转入37℃、5%CO2孵箱中培养。采用CCK8法检测细胞的增殖活性,流式细胞术进行细胞凋亡和细胞周期分析,以及采用扫描电镜和透射电镜观察细胞的超微结构变化。增殖实验在96孔板进行,每组1板共6板。实验组和对照组细胞数均调整为4000个/100ul/孔,每组12孔。细胞铺板后放于孵箱中培养3个小时基本贴壁后,对细胞进行次声和空气暴露的处理,之后在每天的相同时间段处理细胞1次,连续处理3天,处理结束后,迅速将细胞转入孵箱中培养。细胞铺板后48小时进行CCK8检测,每天一次,共观察3天,每天每培养板取4个复孔。凋亡实验和周期分析实验时,将细胞用培养基重悬后,移至5ml冻存管中进行次声和对照组的处理,处理结束后将细胞吹打重悬、转入25cm2培养瓶中,用含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基在孵箱中培养3天。电镜超微结构观察实验时,将细胞用培养基重悬后,移至5ml冻存管中进行次声和对照组的处理,处理时间为60min。用于扫描电镜观察的细胞在处理完后,用全培液重悬并且转入放有消毒盖玻片的培养皿中,迅速移入孵箱中培养,过夜。用于透射电镜观察的细胞在处理完后,转入25cm2培养瓶中,用含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基在孵箱中培养4天。各组数据以(X±S)表示,采用Spss13.0软件处理。对OD值的处理用析因设计资料的方差分析,对凋亡率和细胞周期分布率用t检验分析,P<0.05为差异有统计学意义。结果1、台盼蓝结果显示,细胞活力在95%以上,可以进行下一步实验。2、表面标志物检测显示：CD29和CD90阳性,CD45阴性。3、采用CCK8法检测的结果：采用析因设计的方差分析显示,经次声处理10min、30min和60mmin的BMSCs,培养48h后,OD值分别为(0.929±0.042；1.094±0.013；1.410±0.016),培养72h后,OD值分别为(1.480±0.001；1.348±0.027；1.493±0.017),培养96h后,OD值分别为(1.774±0.127；1.731±0.062；1.833±0.054),对照组三个培养时间的OD值分别为(1.148±0.088；1.147±0.030；1.112±0.051),(1.479±0.051；1.267±0.006；1.227±0.126)和(1.567±0.032；1.563±0.043；1.632±0.071),可见培养72h后次声组细胞OD值均大于对照组,且随着处理时间的延长,细胞OD值呈现递增或先减后增的趋势,在各观察点次声处理60min的BMSCs OD值都最高。采用t检验进行单独效应分析,可见两组间差异有统计学意义(P<0.05)。4、细胞凋亡结果显示：次声处理10mmin和60min时,BMSCs的早期凋亡率分别为(1.07%±0.12%和0.97%±0.21%),相应对照组的早期凋亡率分别为(1.43%±0.06%和3.33%±0.15%),可见次声处理10min和60min后细胞早期凋亡率降低(P<0.01),处理60min还可降低BMSCs的中晚期凋亡率、提高正常细胞百分率(P<0.01),处理30min时,对BMSCs的细胞凋亡没有影响。5、细胞周期结果显示：次声处理10min和30min相比,可对BMSCs的细胞周期产生相反的影响,次声处理10min时,静止期细胞多于对照组(P<0.05),处理30min时静止期细胞少于对照组(P<0.01),而次声处理60min对BMSCs的细胞周期无影响(P>0.05)6、扫描电镜下显示：次声处理60min培养1天的细胞在细胞大小、形状、表面微绒毛程度与空气暴露对照组有较大差异,次声组细胞多舒展开,为长条状,细胞较长,表面微绒毛较多；对照组含有大量圆形透亮细胞,表面微绒毛较少,提示细胞死亡或活力低下。7、透射电镜下显示：次声处理60min培养4天的细胞与对照组细胞相比,细胞状态良好,细胞器大量存在,细胞核没有明显改变,核膜清晰；对照组有大量细胞出现核破裂、核溶解,可见大量溶酶体出现,提示细胞大量死亡。结论1.次声可以促进BMSCs的增殖,没有发现次声引起BMSCs的凋亡,次声处理细胞60mmin后可抑制细胞凋亡；次声作用3天后大多数BMSCs停留在静止期,但次声可以干扰BMSCs的周期分布。次声可对BMSCs的超微结构产生影响,提示次声可以改善细胞活力。2.次声作用60min后,可以稳定的促进细胞增殖,抑制细胞凋亡,不改变细胞的正常周期分布,对细胞超微结构有积极作用,比较适合在骨髓间充质干细胞培养中应用。