猪流行性腹泻（Porcine Epidemic Diarrhea,PED）是由猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）引起的高度接触性肠道传染病。各年龄段猪均易感,但以哺乳仔猪感染更为严重。近些年来,该病呈现了新的流行特征,表现为死亡率极高（90-100%）,患病仔猪日龄更低。自2010以来,PED大范围流行,疫苗防控效果不是很理想,这与长期免疫压力下的PEDV基因变异导致免疫原性及毒力改变有关,因此急需研制针对新流行毒株的新一代PEDV疫苗。实验室前期研究中利用RNA定点重组反向遗传操作技术,将经典疫苗株DR13的S基因替换成当前流行毒株S基因构建了重组PEDV（命名为rPEDV-D375F）。在此基础上,本课题以重组PEDV的实验室培养工艺为切入点,探索提高抗原有效含量的灭活疫苗制备方法和相关技术工艺,并初步评价该疫苗的免疫效果,从而为研发重组rPEDV-D357F灭活疫苗打下良好技术基础。主要研究内容和结果总结如下:1)生产用Vero细胞库的建立与检验。论文中将Vero细胞从第1代连续传至第100代,建立PEDV生产用细胞库,并对不同代次的细胞进行无菌检验、支原体检验、外源病毒检验、胞核学检验和致瘤性检验。结果显示Vero细胞没有任何污染且符合疫苗生产用细胞的基本要求,可作为PEDV生产用Vero细胞库。2)重组猪流行性腹泻病毒的实验室培养工艺建立。为了获得稳定高滴度的重组猪流行性腹泻病毒毒株（rPEDV-D375F）,论文通过对该重组毒株的最佳感染复数（MOI）、感染时间、培养温度和收毒方式进行优化,建立重组PEDV的培养工艺。结果显示,rPEDV-D375F的最佳感染复数MOI为0.01、最佳感染时间为18-20 h、最佳培养温度是37°C、最佳收毒方式为反复冻融3次。该工艺可以保证重组毒株的滴度稳定在10^6.5TU/m L以上。3)rPEDV-D375F灭活疫苗的制苗及其免疫原性评价。论文首先对重组病毒rPEDV-D375F灭活条件进行摸索,确定最佳灭活条件为使用0.2%甲醛在37°C条件下灭活24 h。然后,用上述灭活病毒与206佐剂制备灭活疫苗,并对其进行物理性状检验、无菌检验和安全性检验。最后,以检验合格的灭活疫苗(含毒量1×10^6.5TU/m L)免疫二组PEDV阴性长白猪（4头/组）,免疫剂量分别为4 m L/头·次和8 m L/头·次,首次免疫后第14 d再加强免疫一次,免疫剂量同前。分别于免疫前和免后不同时间采集血液分离免疫血清,检测特异性抗体。结果显示低剂量免疫组（4 m L/头·次）实验猪于免疫后14 d开始产生特异性抗体,21 d达到峰值,49 d抗体仍持续产生;高剂量免疫组（8 m L/头·次）实验猪于免疫后7 d即有特异性抗体产生,21 d达到峰值,77 d时抗体仍持续产生。结果表明自行制备的重组猪流行性腹泻病毒灭活苗具有良好的免疫原性。综上所述,本研究分别成功建立了PEDV生产用Vero细胞库以及滴度稳定在1×10^6.5TU/m L以上的重组毒株的实验室培养工艺。制备了重组PEDV灭活疫苗,并经猪体免疫试验证实其具有良好的免疫原性。本项研究为研发PEDV灭活疫苗奠定了坚实的技术基础。