肿瘤是危害人类健康的重大疾病。降低化疗药物的副作用,增强疗效,克服耐药性等研究,以及多靶点的药物联合治疗方式和新的抗肿瘤机制的应用仍是肿瘤治疗的重点问题。铁死亡（Ferroptosis）是一种新近发现的细胞调节性死亡方式,其核心病理机制是细胞内铁依赖的脂质过氧化通路和脂膜抗氧化系统失衡,致使过氧化脂质过度积聚,引起脂膜结构损伤和功能丧失,继而死亡。该死亡模式的发现引发生物界极大关注,并为肿瘤化疗药物研发及治疗等开创了新的领域。为了维持快速的物质代谢和能量代谢,癌细胞与正常的非癌细胞相比,铁需求增加。这种铁的依赖性可以使癌细胞更容易受到铁催化死亡即铁死亡的影响。人体不同组织内的铁元素含量以及在铁吸收、转运、储藏和释放以及排出等代谢过程中起着不同作用,其中肠道、肝脏、血细胞等组织细胞含量颇丰,铁代谢旺盛,且它们对应的肿瘤在危害人类健康的肿瘤谱中位居前列,这类肿瘤对铁死亡诱导剂是否更加敏感?基于铁死亡机制的联合用药是否更加有效?这些均是非常重要且亟待回答的问题。近年来大量研究结果证实,青蒿素类化合物（ARTs）具有确切的广谱抗肿瘤疗效。ARTs抗肿瘤作用具有以下特点:1)毒副作用相对较小;2)作用机制不同于传统化疗药物,联合当前常用化疗药物可取得良好增效作用;3)能逆转肿瘤细胞的多药耐药,提高肿瘤细胞放化疗敏感性;4)对一些目前尚缺少有效治疗药物之肿瘤（如胰腺癌等）有效。虽然青蒿素及其常用衍生物具有上述抗癌优势,但由于ARTs特殊的分子结构和化学性质致使该类药物存在着制剂困难的问题,另外,总体来看ARTs存在抗癌效价不高,选择性相对较低等缺憾,但这些特点无疑为联合用药、增效减毒提供了广阔的研究空间。因此,ARTs有望成为未来肿瘤临床组合治疗方案的常用药物之一。因此,本文以诱导肿瘤细胞铁死亡为基础,将双氢青蒿素其与目前一线抗肿瘤药物或一些前体化合物联合,筛选出具有协同增效的药物组合,同时进行协同机制的探讨,以期能够达到增效减毒的作用,并为临床应用提供基础数据。一、双氢青蒿素抗癌联用药物的体外筛选将双氢青蒿素（DHA）、全反式维甲酸（ATRA）、13-顺式-维甲酸（13-CRA）、维甲酰酚胺（Fen）、芳维甲酸（TTNPB）、索拉菲尼（Sora）、达拉非尼（Dab）、维莫非尼（Vem）、PLX-4720（PLX）、盐酸吉西他滨（Gem）分别与HepG2细胞孵育24 h,48 h,72h后,使用MTT法检测对肿瘤细胞的抑制率,计算药物对HepG2细胞的半数抑制浓度（IC50）,发现 DHA,ATRA,13CRA,Fen,Sora,PLX,TTNPB,Dab,Vem,Gem 在 48 h 的 IC50 分别为 19.46 μM,107.33 μM,104.58 μM,6.21 μM,6.21μM,55.54 μM,44.49 μM,121.43 μM,18.79 μM,0.82μM。根据各药物的 IC50值,以固定的浓度比例设置浓度梯度组合,将各药物分别与DHA联用,与细胞共孵育48 h后,使用MTT法检测对肿瘤细胞的抑制率,使用Calcusyn软件进行协同作用分析,计算联合指数（CI）;发现在HepG2细胞中,DHA分别与Sora,ATRA,Fen,PLX联用在24 h,48 h以及72 h时均显示出协同抑制HepG2细胞增殖的作用（CI<0.9）。二、不同肿瘤细胞系对铁死亡诱导剂敏感性的考察为了探讨了不同肿瘤细胞系对铁死亡诱导剂的敏感性,我们使用MTT法,检测了人髓性白血病K562细胞,人肝癌HepG2细胞,人结肠癌SW480细胞,人肺癌A549细胞,人神经胶质细胞瘤U251细胞对铁死亡诱导剂DHA与Sora的敏感性。发现K562细胞对DHA最为敏感,在24 h时DHA的IC50为2.76μM;其次为HepG2细胞和SW480细胞,在24 h时DHA的IC50分别为16.16 μM和24.29 μM;A549细胞与U251细胞对DHA的敏感性较低,24 h时DHA的IC50分别为 96.7 μM 和 154.2 μM。与 DHA 相似,Sora 24 h 时在 K562,HepG2,SW480,A548,U251 细胞中的 IC50 分别为 5.38 μM,12.55 μM,11.79 μM,20.61 μM,23.1 μM。我们在Sora 10μM和DHA 20μM诱导的一组人癌细胞死亡百分率的相关性分析中发现,Sora引起的细胞抑制与DHA引起的细胞抑制呈正相关（r=0.9850,p=0.0022）。结果表明,相对于其他部位的肿瘤细胞,铁死亡诱导剂对小肠、肝脏以及血液中的肿瘤细胞可能具有更明显的抑制效果。三、DHA联合Sora在体抗移植瘤实验将1.5×106个HepG2细胞接种到BALB/c裸鼠的右侧腋下;当肿瘤大小达到300 mm3时,将小鼠随机分为4组,每组7只;每天分别灌胃给药DHA 40mg/kg,腹腔注射给药 Sora 10 mg/kg,DHA40mg/kg+Sora 10 mg/kg 的组合剂量,对照组使用相同体积的溶剂。每周使用数字卡尺测量一次肿瘤结节的大小,并称重裸鼠重量。给药三周后,处死小鼠,剖取肿瘤称重,进行H&E染色。在实验结束时,与对照组相比,接受治疗的小鼠的体重没有明显变化。测量裸鼠瘤体积,联合用药组瘤体积为420.60±175.65 mm3相比Sora 10 μM单用组瘤体707.95±202.17 mm3显著降低（P<0.05）,相比DHA40 μM单用组瘤体积902.59±226.84 mm3显著降低（P<0.01）。联合用药组瘤重为0.57±0.19g相比Sora 10 μM单用组瘤重0.81±0.14g显著降低（P<0.05）,相比DHA40 μM单用组瘤重1.04±0.22g显著降低（P<0.01）。H&E染色结果表明,对照组,Sora单用组和DHA单用组分别出现约30%、57%和47%的细胞死亡区域;DHA与Sora联合治疗显示大面积的细胞形态模糊和细胞核染色消失,切片中显示约80%区域的细胞死亡。四、DHA单用及联合Sora对HepG2细胞L-ROS,MDA,LIP以及GSH的影响将药物与HepG2细胞共同孵育24 h,使用荧光探针Calcein AM和BODIPY 581/591 C11分别检测细胞内的不稳定铁池（LIP）和脂质活性氧（L-ROS）,使用脂质过氧化物丙二醛（MDA）检测试剂盒检测细胞内MDA水平,使用还原型/氧化型谷胱甘肽（GSH/GSSG）检测试剂盒检测细胞内GSH水平。与对照组相比,DHA20 μM与Sora 12 μM单用均能显著增加细胞内L-ROS水平（P<0.05）,MDA水平（P<0.05）以及LIP水平（P<0.01）,并能显著降低还原型GSH 水平（P<0.05）;DHA 1OμM联用Sora 12μM后,相比DHA 10μM单用,能显著增加细胞内L-ROS,MDA以及LIP水平（P<0.01）,显著降低GSH水平（P<0.01）。结果表明,DHA和Sora均可升高HepG2细胞内L-ROS,MDA以及LIP水平,降低还原型GSH水平,破坏HepG2细胞内的铁离子稳态以及氧化还原平衡,加速细胞内脂质过氧化的产生,因此DHA与Sora可通过诱导细胞铁死亡的相同作用机制起到协同作用。五、DHA单用及联合Sora对铁死亡相关蛋白的影响将药物与HepG2细胞共同孵育24h后裂解细胞,提取总蛋白后,使用BCA蛋白试剂盒定量。Western Blot法检测谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）,血红素加氧酶1（HO-1/HMOX1）,铁反应元件结合蛋白2（IREB2）,谷氨酸半胱氨酸连接酶催化亚基（GCLC）,半胱氨酸/谷氨酸反向转运蛋白轻链亚基（SLC7A11/xCT）相对水平。我们发现,与对照组相比,DHA在10μM条件下能够显著降低细胞内xCT,GPX4,GCLC以及HO-1水平（P<0.01）;Sora在6μM条件下能够显著降低细胞内 xCT,GPX4,GCLC,IREB2以及HO-1水平（P<0.01）。与DHA 10μM单用组相比,DHA10μM与Sora 6μM联用后细胞内xCT,GPX4,GCLC,IREB2以及HO-1水平显著降低（P<0.01）。结果表明,DHA与Sora能够通过干扰铁依赖的脂质过氧化以及半胱氨酸-GPX4抗脂质过氧化两条通路的平衡,共同诱导HepG2细胞铁死亡。六、DHA单用及联合Sora对HepG2细胞有氧糖酵解及氧化磷酸化的影响将药物与HepG2细胞共同孵育8h后,使用Seahorse XF糖酵解速率测定试剂盒检测细胞的糖酵解速率的变化,使用Seahorse XF细胞线粒体压力测定试剂盒,检测细胞的氧化磷酸化能力。我们发现,与对照组相比,DHA在10μM,20 μM,30 μM剂量时均能显著降低细胞的糖酵解速率（P<0.05）,且具有剂量依赖性;与DHA 10 μM单用组相比,DHA 10 μM与Sora 12 μM联用后细胞的糖酵解速率显著降低（P<0.01）。与对照组相比,DHA在8 μM,12 μM,15μM剂量时均能显著降低细胞的最大呼吸能力以及备用呼吸能力（P<0.01）,降低氧化磷酸化ATP合成能力（P<0.01）,并增加质子泄漏（P<0.01）;与DHA10μM单用组相比,DHA 10μM与Sora5 μM联用后能显著降低细胞的线粒体最大呼吸能力（P<0.01）,备用呼吸能力（P<0.01）以及ATP合成能力（P<0.01）,并能够加速损伤线粒体引起质子泄漏（P<0.05）,使线粒体氧化磷酸化能力进一步降低。结果表明,DHA能够抑制HepG2细胞的有氧糖酵解及氧化磷酸化功能;DHA与Sora联用后起到了协同抑制细胞抑制能量代谢的作用。