蛇足石杉(Huperzia serrata(Thunb.)Trev.)又名千层塔,因体内含石杉碱甲的成分而备受关注。石杉碱甲来源于野生的蛇足石杉植株,目前尚未出现可以替代石杉碱甲的其他天然产物,资源紧缺已成为制约石杉碱甲药物开发的瓶颈。本研究利用光学显微镜对蛇足石杉孢子及孢子囊的发生和发育进行显微结构观察,对人工培养的蛇足石杉孢子进行生活力及生理指标测定,同时筛选出与孢子生长相关基因HsKNOX1、HsKNOX2;除此之外,利用SSR分子标记技术在蛇足石杉近缘物种中进行了遗传多样性分析,确立了蛇足石杉、皱边石杉、四川石杉、小杉兰之间的亲缘关系,研究结果如下:(1)对蛇足石杉孢子及孢子囊的显微结构观察可以看出,蛇足石杉的孢子囊壁分为内层和外层,成熟期的细胞壁达到4-5层;蛇足石杉的孢子从生长初期到孢子成熟的整个过程中,孢子囊中孢子的数量不断增加,后释放;绒毡层作为孢子囊壁的最内一层,紧靠孢子内壁,对孢子的发育具有重要的作用;在孢子成熟期,绒粘层开始退化断裂,这也说明了在发育的后期,绒粘层发挥的作用较少。(2)对不同培养时期蛇足石杉孢子的活力进行了测定,首先对测定方法进行了筛选,最终确定为亚甲基蓝法,测定结果表明随着培养时间的增长,蛇足石杉孢子的活力呈现下降的趋势。同时对培养过程中蛇足石杉孢子的SOD酶活性、可溶性蛋白及脯氨酸的含量进行测定,可溶性蛋白的含量随着培养时间的增长呈现急剧下降的趋势,脯氨酸的含量也是随着培养天数的增加,逐渐下降。SOD酶活性随着培养天数的增加,清除自由基的能力也随之增强。(3)成功克隆出蛇足石杉HsKNOX1、HsKNOX2基因,HsKNOX1基因的ORF区共有1524个碱基,HsKNOX2基因共有756个碱基。利用软件对这两个基因对应的蛋白序列进行生物信息学预测,预测结果包括以下几个方面:HsKNOX1蛋白由507个氨基酸组成,HsKNOX2蛋白由251个氨基酸残基组成;将蛇足石杉的HsKNOX1、HsKNOX2蛋白的序列与数据库中同源序列比对,得出蛇足石杉与小杉兰的亲缘关系最近;HsKNOX1蛋白属于KNOX蛋白家族的KNOXⅡ类,而HsKNOX2蛋白属于KNOX蛋白家族的KNOXⅠ类;通过对两种蛋白的结构和功能进行分析,得出两者均属于典型的KNOX蛋白家族;通过在线软件分预测三个蛋白的亚细胞定位,两个蛋白均定位在细胞核中,通过在线软件分析可以为后期深入蛋白层次研究奠定理论基础。(4)通过对蛇足石杉不同居群中SSR引物的筛选,并在其近缘物种皱边石杉、四川石杉、小杉兰共3个物种天然居群的15个个体进行SSR验证,得出每个基因位点中全部是多态的,即多态位点比率达到100%。各基因位点在四种石杉属植物中的主要基因片段大小初步显示了四种石杉属植物的种间关系密切,其中小杉兰与蛇足石杉亲缘关系最近。通过验证,进一步筛选出可用于石杉科石杉属植物的遗传多样性分析的多态性引物。