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第一部分再生障碍性贫血小鼠骨髓T细胞表面CD28、CTLA4水平检测及其意义目的:建立再生障碍性贫血小鼠模型。体外观察再障小鼠骨髓T细胞表面CD28、CTLA4的表达变化及其意义。方法建立免疫介导再障小鼠模型,分离再障小鼠和正常组小鼠骨髓单个核细胞(BMMNC),体外利用植物血凝素(PHA,终浓度为15μg/ml)特异性激活T细胞,用双色免疫荧光标记流式细胞术检测正常小鼠和再障小鼠于PHA刺激前后骨髓T细胞表面CD28和CTLA4的表达水平。结果PHA刺激培养48小时后,正常小鼠和再障小鼠骨髓T细胞表面CD28和CTLA4的表达较刺激前均明显升高(P<0.0 1);而且再障小鼠PHA刺激培养前后T细胞CD28的表达均显著高于同期正常小鼠(P<0.0 1),但CTLA4的表达与同期正常小鼠相比虽略有升高,但差异无显著性(P>0.05)。结论再障小鼠骨髓T细胞激活及其激活潜能增强,免疫分子CD28和CTLA4在骨髓中的异常表达可能参与了再障T细胞免疫功能紊乱,或是紊乱的表现之一。第二部分再生障碍性贫血小鼠骨髓淋巴细胞Th1/Th2细胞亚群漂移与转录因子T-bet和GATA-3的调控作用目的:探讨再障小鼠骨髓淋巴细胞的Th1/Th2细胞亚群的漂移与转录因子T-bet和GATA-3的调控作用。方法:分离正常小鼠和再障小鼠的骨髓淋巴细胞,在终浓度为15μg/ml植物血凝素(PHA)条件下培养,用双抗体夹心ELISA方法检测小鼠骨髓淋巴细胞培养上清中Th1类细胞因子IFN-γ和Th2类细胞因子IL-4的水平;用RT-PCR技术检测小鼠骨髓淋巴细胞IFN-γ、IL-4以及转录因子T-bet和GATA-3 mRNA表达强度;Western Blot方法检测T-bet和GATA-3的蛋白表达水平。结果:①再障小鼠骨髓淋巴细胞分泌Th1/Th2类细胞因子INF-γ和IL-4浓度及其在淋巴细胞中mRNA的表达水平均显著高于正常组(P<0.0 1),而IL-4基因和蛋白水平明显低于正常组(P<0.0 1);②再障小鼠骨髓淋巴细胞转录因子T-bet基因和蛋白水平显著高于正常组(P<0.0 1),而GATA-3基因和蛋白水平明显低于正常组(P<0.0 1);相关性分析显示,再障小鼠IFN-γ浓度与T-bet蛋白水平呈正相关,与GATA-3无相关性,而L-4浓度与GATA-3呈正相关,与T-bet呈负相关。结论:再障小鼠骨髓出现T细胞向Th1亚群漂移现象,导致机体Th1细胞的优势应答状态,从而诱导细胞毒性T细胞对造血干细胞的细胞毒作用,而T-bet表达增强与GATA-3低表达可能是再障小鼠骨髓Th1优势分化的重要原因。第三部分融合蛋白CTLA4Ig对再生障碍性贫血小鼠骨髓T细胞功能的作用研究目的:观察CTLA4Ig对再生障碍性贫血小鼠骨髓T细胞增殖、Th1和Th2类细胞因子表达水平以及T细胞对靶细胞的细胞毒活性的影响。方法:利用同种异体来源的树突状细胞(DC)作为抗原和抗原提呈细胞,在终浓度为25μg/ml的丝裂霉素C处理后作为刺激细胞,尼龙毛方法分离正常小鼠和再障小鼠骨髓的T细胞作为反应细胞,进行单向混合淋巴细胞培养(MLR),同时加入终浓度为10μg/ml的CTLA4Ig共培养,MTT比色法检测CTLA4Ig对T细胞增殖的影响,ELISA方法检测MLR培养上清Th1和Th2类细胞因子水平变化;体外诱导CTL,乳酸脱氢酶试验检测CTLA4Ig对再障骨髓CTL细胞毒活性的影响。结果:CTLA4Ig可以在体外明显抑制再障小鼠过度的T细胞增殖,并使其降至正常水平;可以下调Th1类细胞因子,上调Th2类细胞因子,诱导再障小鼠骨髓Th1/Th2失衡向Th2的转换,使再障Th1异常优势应答状态恢复正常;抑制再障小鼠CTL细胞的杀伤活性。结论:CTLA4Ig能够在体外抑制再障小鼠骨髓T细胞的增殖、诱导Th1/Th2的转换,恢复再障Th1异常优势应答状态,抑制骨髓CTL的杀伤活性,从而恢复骨髓造血。