【摘 要】
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目的:拟探讨中药蓝布正(Geum japonicum Thunb.var.chinese,GJ)对脑缺血再灌注(Cerebral ischemia reperfusion,CIR)损伤SD大鼠和星形胶质细胞的保护作用,及其相关机制,为蓝布正用于缺血性脑病的临床应用及新药研发提供理论依据。方法:1.GJ提取物对脑缺血再灌注损伤大鼠的保护作用(1)72只雄性SD大鼠随机分为4组,每组18只:假手术组(
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目的:拟探讨中药蓝布正(Geum japonicum Thunb.var.chinese,GJ)对脑缺血再灌注(Cerebral ischemia reperfusion,CIR)损伤SD大鼠和星形胶质细胞的保护作用,及其相关机制,为蓝布正用于缺血性脑病的临床应用及新药研发提供理论依据。方法:1.GJ提取物对脑缺血再灌注损伤大鼠的保护作用(1)72只雄性SD大鼠随机分为4组,每组18只:假手术组(Sham组)、模型组(I/R组)、蓝布正提取物(7.00g/kg)组(GJ-H组)和蓝布正提取物(1.75g/kg)组(GJ-L组)。GJ-H和GJ-L组大鼠分别灌胃给予蓝布正提取物7.00g/kg和1.75g/kg,连续给药7天,假手术和模型组分别给予相应剂量的生理盐水。最后一次给药后,通过线栓法建造大鼠右侧大脑中动脉闭塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型;(2)所有大鼠在缺血再灌注24h后进行神经功能缺损情况的观察,进行神经功能评分;(3)采用TTC染色法对缺血再灌注24h后的大鼠脑进行染色,计算大鼠脑的梗死体积;(4)采用Nissl染色法和TUNEL染色法检测缺血再灌注24h后大鼠皮质尼氏体数量和神经细胞凋亡情况;(5)采用免疫组织化学法检测缺血再灌注24h后大鼠缺血侧皮质Bcl-2、Bax和Cleaved caspase-3的表达;(6)采用Western blot法检测大鼠缺血侧皮质的Bcl-2、Bax和Cleaved caspase-3蛋白的表达。2.GJ提取物对星形胶质细胞的影响(1)将SD乳鼠原代星形胶质细胞分为5组:正常对照组(Control组)、氧糖剥夺模型组(OGD/R组)、氧糖剥夺+蓝布正低剂量处理(1.75g/kg)组(OGD/R+GJ-L组)、氧糖剥夺+蓝布正高剂量处理(7.00g/kg)组(OGD/R+GJ-H组)和抑制剂组(OGD/R+GJ-H组+LY294002组)。除Control组正常条件培养外,其余四组缺氧缺糖培养6h,加入药物及抑制剂10μM后,复氧复糖培养12h建立OGD/R模型;(2)MTT法检测细胞存活率;(3)流式细胞术检测星形胶质细胞凋亡情况;(4)免疫荧光法检测星形胶质细胞标记物GFAP的表达;(5)采用实时荧光定量PCR检测各组星形胶质细胞BDNF、PI3K、Bcl-2、Bax及Caspase-3 m RNA的表达;(6)采用Western blot法检测各组星形胶质细胞BDNF、Trk B、PI3K、p-Akt、p-CREB、Bcl-2、Bax和Cleaved caspase-3蛋白的表达。结果:体内实验结果发现,蓝布正提取物预处理可显著改善缺血1.5h再灌注24h后大鼠的神经功能缺损情况,减少梗死体积,增加大鼠皮质尼氏体数量,减轻神经细胞凋亡情况。同时,蓝布正提取物可显著增加Bcl-2/Bax的表达比例、减少Cleaved caspase-3的表达,且高剂量药物效果更好。体外实验发现,蓝布正含药血清可显著增加氧糖剥夺再灌后星形胶质细胞的细胞活力、减少其凋亡情况、减少GFAP的表达。同时,蓝布正含药血清能显著增加Bcl-2/Bax的表达比例,减少Cleaved caspase-3的表达。此外,蓝布正含药血清能显著增加BDNF、Trk B、PI3K、p-Akt、p-CREB的表达,且高剂量组作用更明显;在加入PI3K通路抑制剂LY294002后,上述基因和蛋白表达被逆转。结论:蓝布正对脑缺血再灌注损伤具有良好的防治作用,其发挥作用可能是通过激活BDNF/PI3K/Akt/CREB信号通路,抑制星形胶质细胞凋亡,从而减轻脑缺血再灌注损伤。
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