目的：多发性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)是一种的浆细胞克隆增殖性疾病。目前尚不能治愈，近些年MM的靶向药物的研究取得了新的进展，去甲基化药物地西他滨(decitabine，DAC)为其中一种。国内外研究均已证实一些MM细胞系中存在异常的高度甲基化，经常发生于富于CpG岛的肿瘤抑制基因(如P15INK4B基因，P16基因，P53基因)启动子区，并导致基因的沉默。DAC是一种核苷类似物，能够在DNA复制过程中掺入DNA，代替肿瘤内的胞嘧啶与DNA甲基化转移酶共价结合，通过与DNMT半胱氨酸残基上的巯基共价结合从而使酶失活。FDA已经正式批准DAC用于治疗骨髓增生异常综合征(MDS)。基础研究表明P16基因的缺失和突变在人类恶性肿瘤中普遍存在，并有报道在检测各种恶性肿瘤细胞系中P16的突变率达30%~80%，P16基因甲基化在多发性骨髓瘤中较为常见。为进一步明确DAC对多发性骨髓瘤细胞增殖抑制及促凋亡的机制，本实验选用多发性骨髓瘤细胞株U266，观察DAC对U266细胞增殖的抑制以及诱导凋亡作用，检测甲基化酶DNMT3AmRNA，P16基因mRNA表达的变化及DAC作用后P16基因甲基化状态改变的情况。为多发性骨髓瘤新的治疗方法提供理论依据。方法：1常规方法培养人多发性骨髓瘤细胞株U266，每48--72小时传代一次。选用对数期细胞进行试验。每组实验重复3次。2CCK-8法检测不同浓度的DAC单药对多发性骨髓瘤细胞U266增殖的影响：DAC的终浓度分别为0.2、0.5、1.2mmol/L，单药组分别作用24h、48h、72h观察U266细胞的抑制率。计算公式为：细胞增殖抑制率(%)=(1-实验组OD值/对照组OD值)×100%。3AnnexinV/PI双染法检测不同浓度的DAC对U266细胞凋亡的影响，药物作用浓度同方法2，观察单药作用24h、48h、72h的凋亡率。4流式细胞仪检测不同浓度DAC作用72小时后细胞周期分布变化。70%乙醇透膜处理细胞。后加入RNase孵育，加入PI(Propidium idodide染色剂)染液室温避光染色30min。药物浓度同方法2。5实时荧光定量PCR法(real-time Q-PCR)检测P16基因mRNA，DNMT3AmRNA的表达情况。收集终浓度为0.2、0.5、1.2mmol/L的DAC分别作用48h后的细胞，提取总RNA，逆转录合成cDNA后，real-time-PCR法检测P16基因mRNA，DNMT3AmRNA的表达。记录各组目的基因及内参基因CT值，应用公式F=2-△△CT计算，△△CT值=（待测组目的基因CT值‐待测组内参基因CT值）‐（对照组目的基因CT值‐对照组内参基因CT值），得相对表达量。 DNMT3A、P16基因及内对照基因引物序列：DNMT3A上游引物：5’-TATTGATGAGCGCACAAGAGAGC-3’；下游引物：5’-GGGTGTTCCAGGGTAACATTGAC-3’；片段长度：113bp。P16上游引物：5’-CGGAAGGTCCCTCAGACATC-3’；下游引物：5’-TCATGAAGTCGAC AGCTTCCG-3’；片段长度：385bp。β-actin上游引物：5’-GTGACATTAAGGAGAAGCTG-3’；下游引物：5’-CTAGAAGCATTTGCGGTGGAC-3’；片段长度：510bp。6甲基化特异性PCR法(MSP法)检测DAC浓度作用48小时前后P16基因的甲基化状态。药物浓度同方法2。 MSP法检测三种不同浓度的DAC作用于U266细胞48h后甲基化状态，设不加药的空白对照组。MSP法过程：经过亚硫酸氢盐处理DNA，DNA片段中未甲基化的胞嘧啶转换为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变。设计针对甲基化及非甲基化位点的引物各一对，PCR扩增。若甲基化引物能扩增出片段，说明该检测位点存在甲基化，若非甲基化引物扩增出片段，说明存在非甲基化。此方法为定性分析法。7统计学分析：SPSS13.0软件进行分析，先做正态性分布检测，分组资料的表示用均数±标准差。做方差齐性检测，方差齐同，两组比较应用t检验，多组比较应用单因素方差分析；方差不齐，应用非参数检验。P＜0.05为有差异，提示有统计学意义。结果：1DAC对U266细胞增殖抑制的影响不同终浓度(0.2mmol/L,0.5mmol/L,1.2mmol/L)的DAC作用于U266细胞24h、48h、72h后，分别以时间，剂量为变量，进行单因素方差分析。发现随着药物作用浓度的增加和作用时间的延长，增殖抑制率有明显增高趋势。24h后分别为：5.30±1.08(%)，7.50±0.44(%)，22.33±2.18(%)；48h后分别为：11.17±4.75(%)，20.17±5.16(%)，30.40±2.26(%)；72h后：25.80±6.52(%)，43.70±6.71(%)，59.33±2.30(%)。各处理组之间进行统计学分析，除低浓度24h和48h组比较P=0.101外，各组间比较均有统计学意义(P<0.05)。DAC抑制U266细胞增殖，并呈时间，剂量依赖性。2DAC对U266细胞凋亡的影响AnnexinV/PI双染法检测结果显示，不同浓度相同时间下细胞凋亡率逐渐增加，提示DAC诱导U266细胞凋亡呈浓度依赖性。24h、48h、72h不同时间相同浓度下，细胞凋亡率逐渐增加，提示呈时间依赖性。对照组、0.2、0.5、1.2mmol/LDAC组作用24h后：8.23±0.70(%)、13.30±0.75(%)、17.38±0.63(%)、27.58±1.32(%)；48h后：11.33±1.02(%)、16.75±1.84(%)、25.78±6.27(%)、37.53±1.36(%)；72h后：19.25±1.20(%)、27.70±1.85(%)、35.23±3.74(%)、49.18±5.70(%)。随时间延长和药物浓度的增加，统计分析药物组和对照组之间，药物组之间均有统计学差异(P<0.05)。显示DAC可诱导U266细胞凋亡，并呈时间和剂量依赖。实验结果还发现DAC诱导U266细胞凋亡以早期凋亡为主，凋亡率分别是：24h：5.90±0.93(%)、7.43±0.42(%)、11.93±4.02(%)、16.68±4.51(%)；48h：6.93±0.53(%)、11.15±1.72(%)、19.98±7.11(%)、30.40±2.36(%)；72h：16.70±0.85(%)、19.68±2.84(%)、30.95±5.29(%)、42.75±6.19(%)。并呈时间和剂量依赖。3DAC对U266细胞周期的影响PI染色流式细胞术分析结果显示，DAC作用于U266细胞72小时后，G0/G1期细胞逐渐增多，S期及G2/M期细胞均减少。随浓度增加对照组、0.2、0.5、1.2mmol/L药物组G0/G1期细胞分别为：82.01±1.68(%)、89.21±1.22(%)、92.86±1.13(%)、96.75±0.48(%)，统计分析各处理组与对照组，各个处理组间，均有统计学意义(P<0.05)。S期细胞分别为：2.32±0.57(%)、1.19±0.28(%)、0.92±0.37(%)、1.08±0.71(%)；非参统计分析P=0.075，无统计学意义。本试验结果显示应用DAC可减少S期细胞，但并没有浓度依赖性，G2/M期细胞分别为：13.87±2.28(%)、9.12±1.52(%)、5.80±0.47(%)、2.02±0.84(%)。统计分析各处理组与对照组，各个处理组间，均有统计学意义(P<0.05)。提示DAC阻滞U266细胞于G0/G1期，并随剂量增加而作用增强。4DAC对U266细胞DNMT3AmRNA、P16基因表达量的影响Q-PCR结果显示，0.2、0.5、1.2mmol/L三种不同浓度的DAC作用于U266细胞48h同对照组相比，DNMT3A mRNA平均表达水平随药物浓度逐渐降低。设对照组为1，目的基因相对表达量分别为0.77±0.13、0.42±0.11、0.24±0.18倍，0.5、1.2mmol/L组比较P=0.204，无明显差别，其余各组比较有统计学差异(P<0.05)。P16mRNA平均表达水平随药物浓度逐渐增高，相对表达量分别为1.67±0.34、2.48±0.37、3.23±0.30倍，各组间比较均有统计学差异(P<0.05)。5DAC对U266细胞株P16基因甲基化的影响MSP法检测发现U266细胞株中存在P16基因启动子区高甲基化，经过DAC处理后，出现甲基化及非甲基化条带，呈现部分甲基化状态。且随着浓度增加，甲基化条带亮度降低，非甲基化条带亮度逐渐增加。提示DAC可部分逆转U266细胞株P16基因甲基化。结论：1DAC抑制U266细胞增殖，并促进U266细胞凋亡，以早期凋亡为主，呈时间和剂量依赖性。2DAC能使U266细胞周期阻滞于G0/G1期，进而阻滞细胞的增殖，呈剂量依赖性。3DAC能降低DNMT3AmRNA的表达量，增强P16基因mRNA的表达量，并呈剂量依赖性。4MSP法检测U266细胞呈现P16基因启动子区高甲基化，DAC可部分逆转P16基因甲基化。