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真姬菇(Hypsizygusmarmoreus)是一种珍稀食用菌品种,以其丰富的营养价值和广泛的药用价值深受人们的喜爱。真姬菇属于中偏低温型食用菌,温度过高或过低都会对真姬菇的生产造成较大影响。
本研究以真姬菇品种白真姬菇G12为材料,采用了传统的TCA/丙酮法、Tris-饱和酚法及尿素裂解法提取真姬菇菌丝全蛋白,确定了Tris-饱和酚法是一种高效的真姬菇菌丝全蛋白提取方法,所提取蛋白完整性好,产量高,杂质少,适用于后续蛋白质组学的研究。
以真姬菇最适生长温度25℃正常培养三周为正常组,以25℃正常培养三周并高温42℃热激2h为处理组,建立适于真姬菇菌丝全蛋白的双向电泳体系,即采用24cm,pH4-7的IPG胶条,蛋白上样量为1.2mg,上样体积为480μL,被动水化时间16h。IEF程序为:100V1h;500V1h;1000V1h;8000V3h,8000V7h。SDS-PAGE的电泳条件为2W40min,17W6.5h。染色方法为胶体考染过夜。通过双向电泳技术研究比较正常组和处理组之间的蛋白质组差异。利用软件识别蛋白点并获得关于差异蛋白点的分子量、等电点和相对表达丰度的信息,以及凝胶间蛋白点的匹配和定量分析信息。蛋白质表达量差异倍数在3.0以上的12个蛋白差异点,其中4个蛋白点在处理组中表达量上调,8个蛋白点下调。将蛋白质表达量差异倍数在3.0以上的12个蛋白差异点进行MALDI-TOF-TOF-MS初步鉴定和数据库检索,进行功能预测及分析,有7个蛋白有质谱信号,数据库搜索之后4个蛋白得到初步鉴定,3个蛋白为未知蛋白及预测蛋白。还有5个电脑识别的差异蛋白质由于分辨率或灵敏度不够,或者因匹配率覆盖率太低未得到鉴定,因而未能进一步分析。
这些差异蛋白大致归为6个主要的功能类群,包括:(1)糖类和能量代谢(2)参与基因表达调控(3)蛋白质代谢(4)细胞骨架动态变化(5)参与信号转导途径(6)胁迫反应,此外还有转录调控相关、离子运输、氨基酸代谢、核酸代谢、其它功能和未知功能蛋白质。表达量上调的蛋白有Spa2同源结构域(SHD)、DEAD-like解旋酶家族、DEHA2G15532p、热激蛋白70、细胞色素P450;下调的蛋白有SAM域家族蛋白(pH结构域)、锌指蛋白(磷酸化酶家族)、ATPase、DNA修复蛋白、SNF2家族蛋白、肽酶M76家族。