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昆虫的中肠是一个重要的消化和吸收器官,其中中肠干细胞的增殖分化对维持中肠微环境的稳态极为重要。调节中肠干细胞增殖分化的信号通路有多条,如Notch信号通路、Hippo信号通路等。本文以重要的模式生物—家蚕(Bombyx mori)幼虫作为试验材料,对幼虫不同发育时期的中肠组织的细胞形态分布进行观察,不同时期的中肠上皮细胞的分化情况进行分析,并对幼虫的中肠上皮组织进行转录组测序,利用荧光定量 PCR对不同时期Notch信号通路中的部分基因的表达水平进行检测。主要结果如下: 1、利用石蜡切片的方法对3龄至4龄、4龄至5龄蜕皮前固定时期、眠期、蜕皮时、蜕皮后1h以及蜕皮后4h这5个时期的家蚕幼虫中肠上皮组织的发育结构等进行观察。发现在幼虫的眠期,在中肠基底膜附近的干细胞最为密集,含量最高。杯状细胞与柱状细胞等在蜕皮前期脱落入中肠肠道内部。在蜕皮后,由于干细胞分化为其他种类细胞,其数量明显减少。 2、利用胰蛋白酶酶解的方法,对3龄至4龄、4龄至5龄蜕皮前固定时期、眠期、蜕皮时、蜕皮后1h以及蜕皮后4h这5个时期的家蚕幼虫中肠上皮组织进行酶解,并统计各类细胞比例。发现在眠期,中肠干细胞的数量明显高于其余时期干细胞的数量,3龄至4龄、4龄至5龄两个阶段眠期干细胞所占比例分别为57%与52%。在蜕皮后,各类细胞含量基本稳定,处于动态平衡的状态。 3、用转录组测序的方法,对4至5龄家蚕幼虫眠期以及蜕皮后4h的中肠上皮组织进行转录组测序分析。分析发现共有463个显著差异表达基因,其中有369个差异上调基因,94个差异下调基因。这些差异基因共富集到3大类GO功能中,主要富集的GO功能包括单组织进程、细胞部分以及结合。在KEGG中,差异显著的通路共有16条,主要以与代谢相关的通路为主。与调节中肠干细胞增殖分化的 Notch信号通路、Hippo信号通路、Wnt信号通路差异不显著,但其中均有部分基因表达差异显著。其中Notch信号通路中,共有3个差异表达上调基因,2个差异表达下调基因;Hippo信号通路中,共有3个差异表达上调基因,1个差异表达下调基因;Wnt信号通路中共有6个差异表达上调基因。 4、采用荧光定量PCR的方法,对Notch信号通路中差异表达基因在固定时期、眠期、蜕皮时、蜕皮后1h、蜕皮后4h、蜕皮后1d和蜕皮后5d的表达量进行比较。发现蜕皮后4 h与眠期相比,Delta配体(gene7809)、Notch蛋白(gene2894)表达量下调, Mastermind-like(MAML,gene7637)和C末端受体蛋白C-terminal-binding protein(CtBP,gene3412,gene13636)表达量上调,与转录组测序结果趋势相同,但表达量差异不显著。 本试验通过对不同时期家蚕中肠上皮细胞形态分布以及中肠上皮细胞的分化情况进行分析,通过转录组测序和分析,找出与中肠干细胞分化调控的相关通路以及其中的关键基因,分析其在转录水平的表达差异,为家蚕中肠细胞生物学的深入研究奠定基础。