铜对畜禽粪便堆肥过程中微生物群落及抗性基因影响机理研究

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重金属作为饲料添加剂广泛应用于畜禽养殖业中,但大量的重金属会以原药形态残留于畜禽粪便中。好氧堆肥是处理畜禽粪便的重要方式,微生物参与堆肥过程多种有机物质的降解,是影响堆肥效率的重要因素;氮循环功能微生物是氮素转化的关键,直接影响堆肥产品质量。然而,堆肥产品的农业利用已成为抗性基因进入环境的重要途径,严重威胁人类健康。因此,本文以Cu作为畜禽粪便中典型重金属污染物,全面研究了不同浓度Cu对好氧堆肥过程中细菌群落多样性、氮循环功能基因及微生物群落多样性(硝化、反硝化和固氮过程)和抗性基因(抗Cu基因(Copper Resistance Genes,CRGs)、抗生素抗性基因(Antibiotic Resistance Genes,ARGs)及Ⅰ类整合子基因(intl1))的影响,分析了Cu与功能微生物和抗性基因变化的关系,揭示了不同浓度Cu对堆肥过程中功能微生物及抗性基因影响的微生物学机理。取得的主要结果和结论如下:(1)Firmicutes、Proteobacteria和Actinobacteria是堆肥过程中主要的细菌门,高浓度(2000 mg/kg)Cu处理使与纤维素和木质素降解相关的细菌丰度降低(如Bacilli和Truepera),尤其是在堆肥初期阶段。好氧堆肥中后期,高浓度(2000 mg/kg)Cu处理的细菌丰度显著降低,且与低浓度(200 mg/kg)Cu处理和对照处理细菌群落结构存在明显的差异。PICRUSt分析表明,Cu会降低编码纤维素、半纤维素和木质素降解酶预测基因丰度。Network分析表明,不同浓度的Cu会改变堆肥过程中细菌群落的关键微生物和共现性模式,加剧细菌间的竞争关系。冗余分析(RDA)结果表明,Cu、堆肥温度和水溶性有机碳(WSCs)是影响细菌群落变化的主要环境因子,且Cu主要影响高温和降温阶段细菌群落的变化。相关性分析结果表明Cu和部分潜在致病菌呈正相关关系(如Corynebacterium1和Acinetobacter)。(2)Cu会显著降低奶牛粪便好氧堆肥过程中的pH、NH4+-N、NO3--N和潜在氨氧化势(PAO)。实时荧光定量PCR(qPCR)测定结果表明,堆肥过程中氨氧化古菌(AOA)amoA基因丰度显著高于氨氧化细菌(AOB),低浓度(50 mg/kg)和高浓度(500 mg/kg)Cu处理会显著降低amoA基因丰度。变性凝胶电泳(DGGE)结果表明,Cu会改变堆肥过程AOA和AOB的群落结构和多样性。Nitrosomonas和Crenarchaeota是奶牛粪便堆肥中氨氧化过程的主导微生物。(3)高浓度(2000 mg/kg)Cu处理在堆肥后期阶段显著增加nirS、nirK和nosZ反硝化基因丰度和多样性。Proteobacteria是反硝化细菌的主要门类,不同浓度Cu会影响堆肥反硝化细菌群落的组成。Network分析结果表明,Steroidobacter、Nitrosomonas和Paracoccus是影响nirS、nirK和nosZ基因丰度变化的主要微生物,高浓度(2000 mg/kg)Cu处理可能会增加反硝化细菌之间的竞争关系,使反硝化细菌群落更加稳定。RDA结果表明,Steroidobacter、Nitrosomonas和Paracoccus与堆肥中Cu浓度正相关,主要分布在2000 mg/kg Cu处理样品中。(4)在猪粪好氧堆肥前期,nifH基因丰度显著高于其他阶段,但Cu会显著降低堆肥中nifH基因丰度。Cu会改变堆肥前期固氮微生物群落结构,减少固氮微生物群落的多样性。Firmicutes和Clostridium是堆肥过程中丰度最高的固氮微生物门和属,低浓度(200 mg/kg)和高浓度(2000 mg/kg)Cu会减少堆肥过程中Desulfotomaculum、Desulfovibrio和Paenibacillus相对丰度,增加Cupriavidus丰度。Network分析结果表明,Cu会影响堆肥过程固氮微生物群落的共现模式,减少固氮微生物之间的联系。此外,Cu可能会削弱堆肥过程中共生固氮细菌的作用,增加自生固氮菌的作用。(5)经过好氧堆肥后,堆肥产品中pcoA、tcrB、erm(A)、erm(B)和intl1基因的绝对丰度显著下降,而copA和cusA显著上升。高浓度(2000 mg/kg)Cu处理会减缓好氧堆肥对CRGs、ARGs和intl1基因绝对丰度的削减作用。RDA结果表明,NH4+和NO3-对ARGs、CRGs和intl1的分布起重要作用,堆肥温度是造成ARGs、CRGs和intl1丰度降低的主要因素。pcoA、tcrB、erm(A)、erm(B)和intl1与生物有效态Cu浓度呈显著正相关关系。在细菌属水平,Clostridiumsensustricto1主导堆肥升温和高温阶段,Pseudomonas和Corynebacterium1主导降温和腐熟阶段。Network分析结果表明,细菌群落是影响CRGs、ARGs和intl1变化的主要因素。堆肥温度、Cu和细菌群落组成的变化是影响含Cu猪粪好氧堆肥过程中CRGs、ARGs和intl1变化的重要因素。
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