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脂肪氧合酶（lipoxygenase, LOX）催化具有顺,顺-1,4-戊二烯结构的多元不饱和脂肪酸的双加氧反应,如亚油酸、亚麻酸。在面粉加工过程中可催化分子氧对面粉中的具有戊二烯1,4双键的油脂发生氧化,形成的不稳定的氢过氧化物能诱导面筋蛋白质分子聚合,从而起到增强面筋的作用；并且能够破坏胡萝卜素的双键结构,从而使面粉变白。因此,脂肪氧化酶兼具强筋和漂白的功效,可以减少或替代强筋剂溴酸钾及漂白剂过氧化苯甲酰的用量。大豆中LOX含量较高,直接在面粉中添加大豆粉可以改善面粉的加工品质,但是存在成份复杂不宜控制的缺陷；从植物材料中提取LOX成本较高；而通过基因工程,高效表达重组LOX还未见报导,上述原因限制了LOX酶制剂做为食品添加剂在食品加工中的应用。本论文针对LOX表达量不高的问题,从基因工程菌的三个要素——基因、载体、宿主出发,对原核生物Anabaena sp. PCC 7120 LOX基因进行了克隆、序列分析、基因定点突变、E.coli中的异源表达、枯草杆菌表达载体的构建和异源表达以及对枯草杆菌宿主的改造进行了研究,主要结论如下：1.克隆得到原核微生物Anabaena sp. PCC 7120（?）脂肪氧合酶基因。在NCBI数据库中搜索到Anabaena sp. PCC 7120基因组中含有脂肪氧合酶基因,与丙二烯单加氧酶基因（AOS）存在于同一开放阅读框内,编码双功能酶AOS-LOX。运用生物信息学分析软件,发现LOX活性保守位点位于双功能酶C端。根据数据库中已报道的Anabaena sp. PCC 7120 AOS-LOX双功能酶基因序列（NC 003267）设计引物,从3’端PCR扩增得到了一段包含LOX酶活性保守位点的1368 bp的完整读码框基因,编码455个氨基酸,预测活性保守氨基酸位点为His197、His202、His369、Asn373和Ile455,将该段基因命名为ama-LOX。2.实现了ana-LOX基因在E.coli宿主中的高效表达。构建了一个非融合表达的重组表达载体pET-23a-ana-LOX,和两个与分子伴侣融合表达的pET-32a-ana-LOX和1pGS-21a-ana-LOX重组表达载体。转化入E.coli BL21（DE3）,在100μg/mlIPTG的诱导下,16℃和30℃条件下培养,三个重组表达载体均获得了活性ana-LOX的表达,酶活测定显示16℃条件下产量均高于30℃。其中pET-32a-ana-LOX工程菌重组酶产量最高,对E.coli BL21（DE3）/pET-32a-ana-LOX工程菌进行了诱导表达的单因素实验。其中最佳发酵培养基为TY；乳糖做为诱导物最佳浓度为1 g/L；发酵培养基的最佳起始pH值为7.0；最佳诱导时机OD600值为0.4；加入诱导剂后最佳诱导时间为12 h。在最佳发酵条件下,工程菌酶活产量达到810 U/mL,该表达量为以往报导的E.coli工程菌重组LOX产量的50倍以上。pET-32a-ana-LOX重组表达载体在宿主E.coli BL21（DE3）中稳定性良好,传代50代后依然稳定。3.对重组ana-LOX进行了分离纯化和酶学性质研究。用Ni-NTA His Tag Kit对重组ana-LOX进行了一步分离纯化,得到电泳纯的重组ana-LOX单一条带,纯化的重组ana-LOX比活达到13.72×103U/mg蛋白,纯化倍数达到23倍,酶活回收率为61.92%。对纯化的重组ana-LOX性质进行了研究,发现最适pH为6.0,最适反应为45℃。重组ana-LOX热稳定性不高,20℃保温1h残余酶活为84%,50℃条件下酶活半衰期为8min。金属离子Fe2+有激活作用,能提高约82%的酶活；Mg2+、Ca2+有微弱的激活作用；Na+、Zn2+、Mn2+有微弱的抑制作用；Cu2+、Fe3+能够强烈的抑制酶活性。4.对ana-LOX活性中心位点和最短基因长度进行了研究。通过定点突变技术,构建了25个ana-LOX突变基因,分别是His197位点3个突变基因,His202位点3个突变基因,His369位点3个突变基因,Asn373位点3个突变基因,Ile455位点4个突变基因,Ile326位点3个突变基因,Asn419位点3个突变基因和His364位点3个突变基因。对突变基因在E.coli BL21（DE3）中进行了诱导表达研究,初步证实了ana-LOX活性中心保守位点残基为His197、His202、His369、Asn373和Ile455。将ana-LOX基因从5’端逐步缩短,在E.coli BL21（DE3）中进行诱导表达,确定了mini-ana-LOX基因长度为1254 bp,重组酶酶活随基因长度的缩短而逐步降低,当基因长度缩短为1230 bp时,重组酶检测不到LOX酶活性。5.构建了11个枯草杆菌表达载体。3个枯草杆菌诱导型、Sec途径分泌表达载体pHPQR、pHPY、pHPYRo pHPQR在实验室前期构建的pHPQ载体基础上插入了共表达分子伴侣PrsA的PamyE-PrsA-TrpA表达元件；pHPY载体是在pHB-hc载体基础上,引入SacB启动子和SacB信号肽,并且引入了共表达增强子SacY的表达元件P43-SacY; pHPYR在pHPY基础上,插入PamyE-PrsA-TrpA表达元件,共表达分子伴侣PrsA。构建了4个枯草杆菌组成型、Sec途径分泌表达载体pHPSQ、pHPSB、pHPSQR、pHPSBR。以pHB-hc为骨架架,引入P43组成型启动子以及其下游多克隆位点（MCS）,得到pHP43载体。在pHP43载体MCS位点分别引入Sec途径信号肽SamyQ和SnprB,获得两个组成型表达载体pHPSQ和pHPSB。在上述两个载体上分别引入共表达分子伴侣PrsA的元件PamyE-PrsA-TrpA,获得两个表达载体pHPSQR和pHPSBR。构建了4个枯草杆菌组成型、Tat途径分泌表达载体pHPSC、pHPSD、pHPSCA、pHPSDA。在pHP43载体MCS位点分别引入Tat途径信号肽SymZC和SphoD,获得两个组成型表达载体pHPSC和pHPSD。在上述两个载体上分别引入共农达分子伴侣PspA的元件PamyE-PspA-TrpA,获得两个表达载体pHPSCA和pHPSDA。6.构建了12个ana-LOX枯草杆菌重组表达载体。将ana-LOX连接入表达载体获得4个诱导型重组表达载体pHPQ-ana-LOX, pHPQR-ana-LOX, pHPY-ana-LOX, pHPYR-ana-LOX;4个组成型、Sec途径分泌重组表达载体pHPSQ-ana-LOX, pHPSQR-ana-LOX, pHPSB-ana-LOX, pHPSBR-ana-LOX;4个组成型、Tat分泌重组表达载体pHPSC-ana-LOX, pHPSCA-ana-LOX, pHPSD-ana-LOX, pHPSDA-ana-LOX。转入WB800宿主菌,只有4个组成型、Sec途径分泌重组表达载体的工程菌在胞外检测到了酶活。分子伴侣起到促进分泌的作用,同一信号肽的载体,共表达分子伴侣载体的酶活均高于未携带分子伴侣的载体,其中pHPSBR-ana-LOX工程菌胞外活性最高达到46 U/mL,分泌效率也最高为35%。pHPSQR-ana-LOX和pHPSBR-ana-LOX两个载体工程菌在16℃条件下,84h分泌表达的酶活达到最高。7.建立了一套无抗生素筛选标记的枯草杆菌蛋白酶的失活方法。以B.subtilis 168为出发菌株,采用同源重组技术,发生两次双交换后,赖氨酸合成酶基因启动子被置换为Pspac启动子,构建了可受LacI蛋白调控的赖氨酸条件营养型菌株BS-PS,该突变宿主无抗生素抗性标记。BS-PS构建过程中的过渡菌株BS-CM由BS-168做为出发菌株,通过第一次双交换获得,两种菌株在基本培养基和基本培养基加赖氨酸加氯霉素的条件下生长情况不同；BS-PS菌株由BS-CM做为出发菌株,通过第二次双交换获得两种菌株在基本培养基和基本培养基加赖氨酸加氯霉素的条件下生长情况也是不同的。以BS-PS菌株为出发菌株,采用插入失活策略,利用整合突变载体上LacI对Pspac启动子的调控,进而通过控制赖氨酸能否合成做为筛选标记,逐一突变失活了nprE、aprE两种蛋白酶基因,获得了无抗生素抗性标记的蛋白酶缺陷型菌株BS-PS-aI-nI。出发菌株BS-PS,过渡菌株BS-PS-PI,和目的菌株在基本培养基,基本培养基加赖氨酸,基本培养基加赖氨酸加氯霉素三种平板上的生长不同。突变菌株修饰后的蛋白酶分子量与理论预测值一致。