目的:本研究通过比较BPA诱导斑马鱼胚胎不同发育阶段发育毒性的差异,确定斑马鱼胚胎对BPA所致发育毒性的敏感期,并探讨其可能机制。方法:1.斑马鱼胚胎对BPA所致发育毒性敏感期的检测将斑马鱼卵裂期到体节期(1-24 hpf)、咽部期(24-48 hpf)、孵化期(48-72 hpf)的胚胎暴露于25 μM BPA,随后用系统水继续培养至96 hpf,观察死亡率、畸形率、孵化率、心率,以及运动行为改变,筛选BPA对斑马鱼发育毒性的敏感期。2.转录组测序技术学筛选目的基因96 hpf收集各组幼鱼,采用转录组测序技术(RNA-sequsencing,RNA-seq)检测各染毒组幼鱼基因组的改变,分别进行差异表达基因筛选和功能分析后,确定BPA对斑马鱼神经毒性敏感期作用的目的基因,并通过荧光定量PCR对测序结果进行验证。3.斑马鱼基因挽救(Rescue)实验采用显微注射技术在斑马鱼胚胎单细胞期注射人工合成的cypin mRNA进行挽救实验,显微注射的斑马鱼胚胎随即暴露于BPA至24 hpf,进一步观察过表达cypin mRNA后,斑马鱼死亡率、及运动行为改变。结果:1.斑马鱼胚胎对BPA发育毒性敏感期的检测结果发现,BPA处理后卵裂期到体节期(1-24 hpf)染毒组幼鱼死亡率明显增加;自发运动显著下降,表现为10 min自由游泳的运动速度较对照组降低约18.97%;明暗周期刺激下运动距离显著减少,在明周期内下降了 29.7%,在暗周期内下降了 18.4%。而咽部期(24-48 hpf)和孵化期(48-72 hpf)染毒组斑马鱼的心率显著降低,其中咽部期(24-48 hpf)下降更加显著。2.转录组学分析显示,卵裂期到体节期(1-24 hpf)染毒组有显著性差异表达基因131个,其中显著上调39个,显著下调92个。随后通过维恩分析结果筛选发现,卵裂期到体节期(1-24 hpf)染毒组有89个特异性差异表达的基因,其中显著上调31个,显著下调58个。最后,通过差异基因GO富集分析、基因功能分析以及荧光定量PCR发现,卵裂期到体节期(1-24 hpf)染毒组中基因鸟嘌呤脱氨酶(guanine deaminase,cypin)mRNA水平显著下降,因此,我们将cypin作为下一步研究的目的基因。3.斑马鱼基因挽救(Rescue)实验结果显示,cypin mRNA注射后可恢复斑马鱼幼鱼的运动水平,但对斑马鱼死亡率无明显变化。结论:1.BPA对斑马鱼胚胎神经毒性及致死性敏感期为卵裂期到体节期(1-24 hpf),表现为斑马鱼运动行为的抑制及死亡率升高;BPA对斑马鱼胚胎的心脏毒性敏感期为咽部期(24-48hpf)及孵化期(48-72hpf),表现为斑马鱼的心率降低,其中咽部期(24-48hpf)更加敏感。2.斑马鱼胚胎对BPA神经毒性敏感期的机制为:BPA通过下调卵裂期到体节期(1-24 hpf)cypin mRNA的表达来介导神经毒性,并对斑马鱼的运动行为产生影响。