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芽孢杆菌(Bacillus spp.)是土壤和植物微生态系统中的优势微生物种群,具有很强的抗逆能力和抗病作用,其生防机制主要包括竞争作用、拮抗作用和诱导植物抗病性等方面。其产生的细胞壁降解酶(如蛋白酶、几丁质酶、β-1.3-葡聚糖酶等)是重要的拮抗物质之一。已有研究表明,几丁质酶(Chitinase)和β-1.3-葡聚糖酶(β-1.3-glucanase)在生防中的作用与真菌细胞壁结构有关。真菌细胞壁成分较复杂,除了几丁质、β-1.3-葡聚糖以外,还含有多种蛋白质。生防芽孢杆菌产生的胞外蛋白酶可能在协同几丁质酶、β-1.3-葡聚糖酶降解真菌细胞壁、拮抗病原真菌中起到重要作用。本研究首先从真菌细胞壁蛋白质含量入手,对引起山东省主要作物病害的7种病原真菌细胞壁蛋白质含量进行分析,研究了7株生防芽孢杆菌对不同病原真菌的生物防治效果与其3种主要细胞壁降解酶活力的相关性,并进一步利用紫外线(UV)、硫酸二乙酯(DES)及微波(Microwave)对一株具有广谱抗菌活性且产蛋白酶的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)T2进行诱变,以蛋白酶活力变化为筛选指标,研究突变株和出发菌株对病原真菌拮抗作用的变化及粗酶液对菌丝和孢子萌发的影响,以期探明芽孢杆菌胞外蛋白酶在生防中的地位和作用,为优良拮抗芽孢杆菌的直接利用和菌株的遗传改良提供依据。具体结果如下: 1.采用Bradford法测定真菌细胞壁蛋白质含量。结果显示:供试7种病原真菌细胞壁交联蛋白含量均高于未交联蛋白,不同病菌菌丝细胞壁中总蛋白含量存在差异,其中以棉花枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp. vasinfectum)含量最高,达到7.411 mg/g;西瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp. niveum)、黄瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp. cucumerinum),小麦纹枯病菌(Rhizoctonia cerealis)含量相当,其次为烟草赤星病菌(Alternaria alternata)和小麦赤霉病菌(Fusarium graminearum),番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea)含量较少,为2.626 mg/g。2.生防芽孢杆菌的防治效果与菌株细胞壁降解酶活力的相关性研究,是建立芽孢杆菌菌株筛选模型和菌株改良的基础。根据供试7株生防芽孢杆菌的防效和细胞壁降解酶活力,计算相关系数。结果显示:细胞壁降解酶中影响其防效的主要因素是菌株的蛋白酶水平,同β-1.3-葡聚糖酶水平、几丁质酶水平也有一定关系。以细胞壁蛋白含量最高的棉花枯萎病菌(F. oxysporum f.sp. vasinfectum)为靶标时,蛋白酶水平相关系数达0.915,其余相关系数分别为β-1.3-葡聚糖酶0.811,几丁质酶0.572,对黄瓜枯萎病菌(F. oxysporum f.sp. cucumerinum)、小麦赤霉病菌(F. graminearum)及烟草赤星病菌(A. alternata)的研究也得到相同结论;以西瓜枯萎病菌(F. oxysporum f.sp. niveum)为靶标时,菌株几丁质酶水平与其生防效果相关性较好,相关系数为0.824,其余相关系数分别为蛋白酶0.623,β-1.3-葡聚糖酶0.497。3.利用紫外线(UV)、硫酸二乙酯(DES)和微波(Microwave)对枯草芽孢杆菌B. subtilis T2进行诱变,获得了具有良好遗传稳定性的蛋白酶正负突变株。酶活力测定结果显示:与出发菌株相比,培养48 h的正突变株T2-18胞外蛋白酶活力提高108.5%,负突变株T2-2蛋白酶活力降低81.1%,而二者的几丁质酶和β-1.3-葡聚糖酶活力均无显著变化。4.为明确芽孢杆菌胞外蛋白酶在生防作用中的地位及作用,本研究对突变株拮抗性能的变化进行了研究。结果显示:正突变株对棉花枯萎病菌(F. oxysporum f.sp. vasinfectum)的平板拮抗作用增强,其粗酶液可使该菌菌丝变形膨大成珠状、原生质浓缩,萌发的孢子芽管短且畸形膨大;负突变株对该菌的平板拮抗作用显著降低,粗酶液对该菌菌丝和孢子的形态无明显作用。盆栽实验显示:突变株对黄瓜枯萎病的防效存在差异,正突变株T2-18浸种处理的黄瓜苗死亡率仅为40.0%,T2处理组死亡率为54.3%,低于负突变株79.6%和对照处理组80.1%。表明提高生防芽孢杆菌胞外蛋白酶的活力可增强其拮抗病原真菌的能力。5.将突变株在平板上连续传20代,考察其遗传稳定性。结果显示:突变株产酶能力以及对病原真菌的拮抗作用均无明显变化,表明获得的突变株具有良好的遗传稳定性,这对于其在各种生态环境中长期稳定地发挥作用具有重要意义。