研究目的与意义:　　机体或单核-巨噬细胞先以小剂量脂多糖(Lipopolysaccride, LPS)预处理后,表现出对LPS的再次刺激呈低反应或无反应的现象:包括由LPS导致的一系列诸如发热、休克乃至死亡等病理生理现象减轻甚至消失,细胞因子、细胞信号转导分子等发生改变,此为内毒素耐受。内毒素耐受体内模型主要在实验动物中进行,在体外模型方面,主要是培养对LPS敏感的细胞,通过不同剂量LPS处理而得到。大量研究表明,单核巨噬细胞系是内毒素作用的主要靶细胞,亦是产生内毒素耐受的主要效应细胞。产生耐受时,其主要特征表现为TNF-α等细胞因子低表达或无表达。总体而言,LPS耐受现象主要在传统免疫活性细胞中诱导。有证据表明,在一些中枢神经系统疾病的研究中,体内先采用小剂量LPS预处理,诱导的LPS耐受可减低脑内免疫相关的炎症反应,由此发挥一定程度的保护作用。在中枢神经系统,神经胶质细胞(主要是星形胶质细胞和小胶质细胞)是介导免疫反应的关键细胞群,参与许多脑部疾病的发生发展,并表现出多种炎性介质以及信号分子的表达改变。那么,在体内诱导的LPS耐受现象是否也能在体外培养的大脑神经胶质细胞中诱导?其产生耐受的表现是否与其他细胞以及体内实验的表现相似?解答这些问题有利于进一步阐明LPS耐受在脑部疾病中的细胞及分子调节机理。另一方面,在探讨神经胶质细胞中是否存在LPS耐受现象的同时,可进一步了解神经胶质细胞功能的变化规律,如分泌某些炎性因子(HMGB-1)的改变,以及某些重要的信号分子如PI3K/Akt通路在耐受诱导中的作用和重新调配机制。如果LPS预处理大脑皮质胶质细胞后,可诱导LPS耐受,这些细胞发生的功能改变如何影响与之密切沟通的神经元的活性与功能?相关研究表明LPS耐受在减轻疾病炎症反应中有积极的作用,而这些问题的探讨将为LPS耐受在神经系统疾患中的实际应用提供更丰实的实验依据,并为预防与治疗这些神经疾病提供更多有潜在实用价值的思路。　　实验方法:　　1.体外培养混合大脑皮质胶质细胞,经分离纯化鉴定星形胶质细胞与小胶质细胞,采用小剂量(0.01ug/ml)预处理胶质细胞18小时后用较大剂量1ug/ml LPS再刺激24小时。分别经过CCK-8试剂盒、ELISA、免疫荧光、uwestern blotting及RT-PCR检测神经胶质细胞毒性作用、分泌细胞因子功能、NF-κB活性、TLR-4表达情况,探讨这些细胞是否会发生犹如单核巨噬细胞产生LPS耐受时的变化。　　2.通过ELISA、免疫荧光以及western blotting检测LPS预处理后一些重要炎性介质如HMGB-1的转位与蛋白表达情况,以及某些信号通路分子如SOCS-3表达、PI3K/Akt通路的活化情况;同时检测了采用PI3K/Akt抑制剂处理后LPS预激神经胶质细胞HMGB-1的变化情况,由此进一步了解神经胶质细胞经过预激后功能的变化规律。　　3.收集预处理后星形胶质细胞与小胶质细胞条件培养上清,将其与神经元进行共孵育,观察神经元的存活情况以及分泌功能,探讨LPS预处理神经胶质细胞发生的功能变化对神经元活性与分泌功能产生的影响。　　实验结果:　　1.在体外采用小剂量LPS预激星形胶质细胞和小胶质细胞,可减低这些细胞细胞毒作用,而且能明显下调分泌其TNF-α水平,这种效应可以持续到再刺激后48小时;同时,TLR-4mRNA表达水平也呈下调趋势;而且,星形胶质细胞中NF-κB激活程度下降,但小胶质细胞NF-κB激活程度未见明显抑制。另外,星形胶质细胞和小胶质细胞经预激后分泌NO、IL-6的水平增加,出现了活化反应表现。　　2. LPS预激星形胶质细胞和小胶质细胞后其HMGB-1蛋白表达及胞浆中转位增加;SOCS-3的表达也增加,另外,PI3K/Akt通路活化增强;采用LY294002先将PI3K/Akt通路抑制后,LPS预激星形胶质细胞和小胶质细胞HMGB-1蛋白表达及胞浆转位减少;SOCS-3的蛋白表达也降低;细胞培养上清中细胞因子TNF-α,IL-6水平均降低。　　3.在星形胶质细胞预刺激组条件培养上清的作用下,神经元存活率降低;在小胶质细胞各组条件培养上清作用下,神经元存活情况变化不大;神经元与星形胶质细胞或小胶质细胞培养上清共孵育后,LPS预激组上清均能上调神经元分泌TNF-α和IL-6的水平;采用PI3K/Akt抑制剂处理,预刺激后胶质细胞的培养上清对神经元存活情况影响不显著,对神经元分泌TNF-α和IL-6有一定影响,但星形胶质细胞与小胶质细胞上清的影响作用表现不一。　　结论:　　1.星形胶质细胞与小胶质细胞本身可以成为LPS耐受效应的靶细胞之一,但LPS预处理后,诱导靶细胞反应性降低的效应,并非是全面的抑制,不同分子有可能表现为耐受或是活化效应。　　2. LPS预刺激对神经胶质细胞中炎性因子的释放以及信号分子进行了重新调配,炎症因子HMGB-1表达和转位与PI3K/Akt通路活化情况表现一致。PI3K/Akt通路对LPS耐受诱导的效应未表现明显负向调节作用。　　3.体外LPS预激神经胶质细胞,其培养上清对神经元存活未见明显促进作用。由于LPS预激可重新调配靶细胞各类炎症因子以及信号分子的表达,在靶细胞培养上清中混合有多种活性分子,其综合效应可对神经元产生不同的生物学影响,可能是保护或是损伤作用。