癫痫是小儿神经系统常见疾病之一。临床上大多数癫痫患儿的发作可获得满意控制,但也有相当一部分虽经早期合理使用一线抗癫痫药物(antiepileptic drugs,AEDs),仍不能得到较好控制而发展成为难治性癫痫(intractable epilepsy,IE),严重影响患儿的智力发育。难治性癫痫中以颞叶内侧癫痫(mesial temporal lobe epilepsy,MTLE)最为常见,其多数起源于颞叶海马,约占全部癫痫患儿的10～30%,但大约有70%的患儿耐药。目前研究认为,癫痫持续状态、早期发病(1岁左右)、新生儿癫痫、热性惊厥、发育期内脑组织受损如脑外伤、感染以及癫痫发作形式的改变等都可能是难治性癫痫的重要相关因素,但其具体的发病机制却至今不明,因此建立与小儿颞叶内侧癫痫发生发展相似的动物模型对研究其发病机制及进行有效治疗有重要意义。MTLE通常被看作是早期损伤诱导海马结构改变、重建的结果。海马形态学异常包括神经元脱失和苔藓纤维出芽,两者均是颞叶内侧癫痫海马的特征性病理改变,并且在癫痫发生中起重要作用:多数学者认为癫痫起始部位、异常放电的传播以及癫痫的临床表现与神经元脱失部位有关,颞叶内侧细胞脱失区域即致癫痫区;苔藓纤维(即颗粒细胞轴突)在病理条件下,能出芽至CA3区锥体细胞层和齿状回内分子层形成新的突触,诱导形成新的反复性兴奋性环路,增加癫痫易感性。除了神经元脱失和苔藓纤维出芽,有些蛋白也与癫痫发生相关,例如胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)和突触蛋白Ⅰ(synapsinⅠ)。GFAP是代表活性星形胶质细胞的细胞骨架中间丝蛋白。星形胶质细胞在中枢神经系统中起着重要作用,如对离子内环境稳定、神经递质释放、突触形成均有调节作用。SynapsinⅠ是磷蛋白家族的一种,它在突触发生、发展和神经递质释放方面有重要作用,被看作是突触再生及具有高兴奋性的神经环路可塑性的标记物。现今大多数癫痫动物实验都以成年鼠为研究对象,少有模拟小儿癫痫的动物模型。研究发现,未发育成熟的大脑与成熟大脑在癫痫致病因素、发生发展、临床和脑电图(EEG)表现、对抗癫痫药物反应以及预后上均有很大不同。本实验中,我们以未成年鼠为研究对象,选用匹罗卡品致痫,研究模型鼠海马形态学改变;通过免疫组织化学和免疫印迹方法检测GFAP、synapsinⅠ在海马各亚区动态表达,并探讨其与发育期大鼠慢性癫痫的关系。第一部分匹罗卡品颞叶内侧癫痫模型的建立及致痫幼鼠海马形态学改变目的建立一种简单可靠、与人类癫痫发生发展特征相似的动物模型。方法取3周龄健康雄性SD大鼠165只,将其随机分为生理盐水对照组(30只)、氯化锂—匹罗卡品实验组(135只)。实验组氯化锂(127mg/kg)联合匹罗卡品(50mg/kg)腹腔注射,诱发大鼠出现癫痫持续状态并持续90分钟后予10%水合氯醛中止,再将存活致痫鼠随机分为致痫后1.5小时、致痫后3周、致痫后8周三个亚组,每天逐只观察存活鼠有无自发痫性发作。对照组给予等量生理盐水腹腔注射,并随机分为生理盐水注射后1.5小时、3周、8周三个亚组。实验组及对照组每亚组再分为两部分,一部分灌注固定制备切片行尼氏染色、Timm染色,以及GFAP、synapsinⅠ免疫组织化学染色,另一部分取大脑海马组织行免疫印迹分析。结果1、实验组135只大鼠中94.1%成功诱发出现癫痫持续状态,但死亡率高达68.8%。致痫后8周组大鼠中70%成年后出现了反复自发痫性发作和EEG上痫样波发放。对照组大鼠行为及EEG表现无异常。2、致痫后1.5小时组大鼠海马形态学未见有苔藓纤维出芽及神经元脱失的改变,但致痫后3周及8周组大鼠海马均出现了明显的苔藓纤维出芽和神经元脱失。苔藓纤维出芽发生在CA3区和齿状回内分子层,且致痫后8周组与3周组相比有显著性差异(P＜0.01)。海马CA1区、CA3区及齿状回均有神经元脱失,以致痫后3周组脱失最为严重,与相应对照组、致痫后1.5小时组及致痫后8周组相比均有显著性差异(P＜0.01)。致痫后8周组神经元数目恢复,但CA3、CA1区与相应对照组相比仍有显著性差异(P＜0.05)。在海马各亚区神经元数目变化的比较中,以CA3区最为明显。结论利用氯化锂、匹罗卡品联合致痫,建立了一种简便可行、与人类颞叶癫痫相似的发育期大鼠慢性癫痫动物模型。神经元脱失和苔藓纤维出芽参与了MTLE的发生发展。第二部分匹罗卡品致痫幼鼠海马组织中GFAP、synapsinⅠ的表达变化研究目的观察癫痫发生发展过程中GFAP、synapsinⅠ在致痫幼鼠海马组织中的表达变化。方法利用第一部分已经建立的颞叶内侧癫痫幼鼠模型,采用免疫印迹和免疫组织化学染色方法,观察海马组织GFAP和各亚区synapsinⅠ的表达变化。结果1、免疫印迹及免疫组化结果均显示GFAP在致痫后1.5小时组的表达与相应对照组比较无显著性差异(P＞0.05),在致痫后3周及8周组的表达与相应对照组及致痫后1.5小时组比较均明显上调,有显著性差异(P＜0.01),致痫后8周组与3周组的差异亦有显著性(P＜0.01)。2、免疫印迹结果显示synapsinⅠ在整个海马组织中的表达变化为:在致痫后1.5小时组的表达较相应对照组明显下降(P＜0.01);致痫后3周时表达明显增加,与相应对照组比较有显著性差异(P＜0.01);致痫后8周组synapsinⅠ表达量再次下降,与相应对照组的差异有显著性(P＜0.01)。免疫组化结果显示synapsinⅠ在海马各亚区的表达变化为:在齿状回及CA3区,致痫后1.5小时组synapsinⅠ表达均下降,与相应对照组比较有显著性差异(P＜0.01);致痫后3周其表达较相应对照组明显上调(P＜0.01),CA3区上调更为显著;随后表达下降,致痫后8周组其表达较相应对照组明显下调(P＜0.01)。在CA1区,synapsinⅠ在致痫后1.5小时组表达下降,与相应对照组比较有显著性差异(P＜0.01);致痫后3周组及8周组的表达与相应对照组相比无下降(P＞0.05)。结论1、致痫幼鼠海马星形胶质细胞的增生和各亚区synapsinⅠ的动态表达变化可能与发育期大鼠MTLE的发生发展相关。2、在海马各亚区synapsinⅠ的动态表达变化对发育期大鼠MTLE发生所起的作用中,CA3区作用可能相对更为重要。