脑血管痉挛(cerebral vasospsam, CVS)是动脉瘤性蛛网膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage, SAH)严重和常见的并发症，也是患者致死致残的主要原因。尽管先前对SAH后诱发脑血管痉挛的因素如血小板释放产物(如5-羟色胺、血管紧张素、儿茶酚胺、钾离子等)、红细胞分解产物(包括氧合血红蛋白和ATP)对血管壁的作用、一氧化氮(NO)与内皮素(ET)之间的失平衡以及离子通道障碍对平滑肌细胞的影响等等进行了大量研究，但是导致脑血管平滑肌持续的收缩的主要原因以及炎性反应在脑血管痉挛的形成中分子机理并不完全清楚，特别是维持平滑肌收缩的蛋白激酶C(protein kinase C, PKC)和与炎性因子转录有关的核因子-κB(nuclear factor kappa B, NF-κB)在痉挛的脑血管变化规律和相互关系也亟待研究。为此，我们采用家兔枕大池二次注血脑血管痉挛模型，从器官组织水平、细胞水平以及分子生物学水平等不同层面对PKC、NF-κB和IκB等细胞因子活性的表达变化进行研究，同时对PKC抑制多肽Myristoylated PKC Peptide inhibitor防止脑血管痉挛作用进行评价，为SAH后脑血管痉挛的防治提供理论依据。本研究分为以下五部分：1 家兔枕大池二次注血模型基底动脉的光镜及电镜研究本研究目是观察实验性家兔二次枕大池注血模型基底动脉形态学及超微结构变化，为研究CVS的发生机制和客观评价干预措施的效果提供形态学资料。雄性中国白兔35只，体重1.5~2.0kg，分为对照组(n=5)和实验组(n=30)。实验组动物在Day0和Day3时经枕大池二次注射自体动脉血(1ml/kg)，分别于Day1、Day3(二次注血前)、Day5(二次注血后2天)、Day7、Day10和Day14时，各取5只动物经主动脉4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液灌注(压力为90mmHg)处死，迅速开颅取出含有基底动脉全<WP=6>长的脑干及脑组织，截取上1/2基底动脉，经4%多聚甲醛溶液再固定24小时，石蜡包埋，连续切片，层厚5μm，苏木素伊红(hematoxin eosin, HE)、马松三色染色(masson’s trichrom stain)，供光镜观察，并测量管腔内径周长和管壁厚度；截取的另外1/2基底动脉置于2.5%戊二醛磷酸盐缓冲液中后固定24小时，环氧树脂包埋，超薄切片，醋酸铀－枸橼酸铅染色供透射电镜 (transmission electron microscopy, TEM)观察。光镜观察：对照组动物的基底动脉HE、 Masson染色显示组织结构正常，基底动脉外膜胶原纤维较薄，平滑肌细胞层细胞外基质很难观察到。实验组动物Day1、Day3和对照组无明显差别，Day5时出现管径变细，内膜出现皱褶、平滑肌细胞肥大、扭曲变形，可见平滑肌细胞外基质，外膜胶原纤维明显增多变厚且有粒细胞和单核细胞浸润；Day7时基底动脉管径狭窄更为明显，内皮细胞出现破损，平滑肌细胞除肥大、扭曲变形外，出现细胞间隙增宽和部分平滑肌细胞坏死，平滑肌细胞层细胞外基质明显增多，并出现中层和外膜分离，外膜胶原纤维进一步增多增厚，炎性细胞浸润更为明显，且向平滑肌层侵润； Day10动脉管径狭窄程度较Day7时减轻，内皮仍有皱折破损现象，平滑肌细胞的肥大、扭曲变形稍有缓解，有细胞间隙增宽和部分平滑肌坏死，平滑肌细胞层细胞外基质增生较Day7时有缓解，仍有中层和外膜分离现象，外膜炎性细胞浸润有减轻，但仍有外膜胶原纤维增生； Day14基底动脉管径基本恢复，内皮仍有少量破损，平滑肌层细胞间隙轻度增宽和少许平滑肌细胞坏死，外膜炎性反应基本消失，胶原纤维增生基本缓解。电镜观察：对照组动物基底动脉结构正常。Day1、Day3仅有轻度内皮细胞空泡变性。Day5出现内皮细胞变性，胞核电子密度降低，胞浆内线粒体肿胀，粗面内质网扩张，内弹力层增厚，疏密不均，中膜增厚，平滑肌胞核染色质密度略底，可见线粒体肿胀，胞膜不清，外膜可见纤维母细胞样变。Day7时内皮细胞脱落严重，胞核出现严重脱颗粒，线粒体空泡变性明显，细胞器减少，紧密连接基本开放，平滑肌细胞可见坏死，空泡变性明显，胞核不规则，可见固缩，外膜可见纤维母细胞增生。Day10仍有内皮细胞脱落，胞核有脱颗粒改变，有的发生固缩，胞<WP=7>质电子密度降低，有空泡变性，紧密连接多处开放，平滑肌细胞出现变性，胞核有脱颗粒，线粒体变性，外膜胶原纤维成束状，有空泡变性，炎性细胞浸润减轻。Day14时内皮细胞偶见脱落，空泡变性少见，平滑肌细胞核密度基本恢复，胞浆电子密度略低，外膜改变基本恢复。结果表明家兔枕大池二次注血模型基底动脉在1-3d时出现轻度内皮细胞空泡变性，5~10d时出现明显的形态学改变，包括动脉管腔狭窄、内皮细胞损伤和平滑肌细胞坏死及外膜胶原纤维增生、炎症细胞浸润等，7d时最为明显。其病理改变与文献报道人类痉挛动脉极其相似。2 家兔枕大池二次注血模型基底动脉PKC变化规律的研究第一部分的研究结果发现枕大池二次注血引起的脑血管持续痉挛可导致平滑肌细胞变性坏死。有资料表明PKC的激活与平滑肌的收缩密切相关。为此，本研究目的是研究PKC在家兔二次注血模型中痉挛的基底动脉中表达和活性的变化规律，探讨PKC在脑血管痉挛形成机制中的作用。雄性中国白兔35只，体重1.5~2.0kg，分为对照组(n=5)和实验组(n=30)。实验组动物在Day0和Day3时经枕大池二?