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研究背景近年来,随着社会经济发展、人民生活水平提高、就业压力增大、生活方式改变、人口急速老龄化和易患因素发病率的逐年上升,心血管疾病已成为危害人们健康的“第一杀手”。由于科技进步,针对心血管疾病的药物和介入治疗取得了长足进步,然而,冠状动脉旁路移植术(CABG)和周围动脉旁路移植术在复杂心血管病变的处理上仍有着不可替代的作用。自体静脉移植物,尤其是大隐静脉移植物(SVG),由于方便取材和管段较长,是动脉旁路移植术中最常用移植物。但是,较之乳内动脉移植物(IMAG),较低的通畅率严重降低了SVG的临床应用价值。因此,如何提高SVG通畅率,仍是众多学者研究的热点。越来越多的临床证据表明极化液(GIK)/胰岛素应用可明显改善CABG术后糖尿病和非糖尿病患者的预后,而且,减少CABG术后糖尿病患者缺血性心血管事件的发生率。我们的前期实验发现GIK不仅对缺血/再灌注(I/R)心肌细胞有保护作用,而且对I/R冠脉内皮细胞具有显著的抗凋亡作用,而其中胰岛素起着关键作用,它是通过PI3K/Akt-eNOS-NO发挥对上述细胞的保护作用。研究发现动脉旁路移植术后早期,移植静脉的内皮细胞(ECs)和血管平滑肌细胞(VSMCs)的凋亡与早中期SVG的失败关系密切:ECs凋亡是SVG附壁血栓形成、新生内膜增生的始动因素,而VSMCs大量凋亡又可促进别的VSMCs增殖和迁移,导致新生内膜过度增生。有学者发现在非胰岛素抵抗状态下,应用胰岛素可抑制大鼠球囊损伤后颈动脉新生内膜过度增生。然而,极化液/胰岛素对I/R移植静脉有何影响,尤其是对I/R移植静脉ECs和VSMCs是否有直接的保护作用及其机制尚不明确。另外有学者发现较持久的胰岛素刺激可促进ECs中eNOS表达的上调,我们推测由此带来的血管内皮功能改善、一氧化氮(NO)释放增加,对动脉血管损伤后新生内膜过度增生有着抑制作用。但胰岛素应用后对在体的SVG新生内膜过度增生有无抑制效应尚未见报道。研究目的1.明确给予胰岛素治疗是否可以减轻在体I/R后移植静脉内皮细胞和血管平滑肌细胞的凋亡程度;2.探讨胰岛素对抗移植静脉ECs和VSMCs凋亡的信号转导机制,尤其是胰岛素与移植静脉PI3K/Akt信号转导途径之间的关系;3.观察动脉旁路移植术后短期内应用胰岛素是否对移植静脉新生内膜过度增生有抑制作用,并探讨可能机制。材料和方法杂种犬40只,雌雄不拘,体重12 ~ 15 kg,随机分为5组,每组8只,以3%戊巴比妥钠静脉注射麻醉后,行颈部单侧倒置颈外静脉-颈总动脉端端吻合模拟动脉旁路移植术模型,分别于移植静脉再灌注前5分钟直到之后4小时,给予以下4种液体以2 mL/kg/h静脉输注:(1)假手术组(Sham:0.9% NaCL);(2)生理盐水(Vehicle: 0.9%氯化钠);(3) GK(葡萄糖-钾液:葡萄糖: 250g/L,氯化钾:80 mmol/L);(4) GIK(葡萄糖: 250g/L,胰岛素: 60U/L,氯化钾:80 mmol/L);(5) GIK+Wort (Wortmannin,2.0μg/kg/h,再灌注前5 min开始,持续1 h静脉输注)。之后取出颈外静脉移植物行TUNEL凋亡染色和激活的caspase-3免疫组化染色,用Western blot法检测颈外静脉移植物中caspase-3活性、Akt和eNOS磷酸化水平。在另一组实验中,杂种犬16只,随机分为2组,每组8只,建立同样模型,分别于移植静脉再灌注前5分钟直到之后4小时,给予以下2种液体以2 mL/kg/h静脉输注:(1)生理盐水;(2) GIK;之后分别给予生理盐水0.5 mL和胰岛素4 U (并按此分为两组),2次/日,皮下注射,连续1月,于术后29天,腹腔注射BrdU(50 mg/kg),24小时后处死犬,取出静脉移植物和正常颈外静脉,分别行BrdU掺入和eNOS免疫组化染色,用Western blot法检测其中α-平滑肌肌动蛋白表达状况,用Verhoeff-van Gieson染色法衡量新生内膜增生程度。实验结果第一部分实验:1.术后短期内移植静脉中存在ECs和VSMCs的大量凋亡;2. GK处理可加重ECs和VSMCs的凋亡(与生理盐水组比较,P < 0.05 );3. GIK可显著降低I/R后移植静脉ECs和VSMCs的凋亡指数(分别与生理盐水组和GK组比较,P < 0.001)和中/内膜caspase-3的激活程度(分别与生理盐水组和GK组比较,P < 0.01);4. GK处理后明显抑制移植静脉中Akt和eNOS的磷酸化,并刺激caspase-3的活化(与生理盐水组比较,P < 0.05),GIK处理后则明显增强了Akt和eNOS的磷酸化(分别与生理盐水组和GK组比较,P < 0.001),并明显抑制caspase-3的活化(P < 0.05);加用Wortmannin后,GIK的这种效应被明显消除;第二部分实验:1.在术后1月,应用胰岛素可明显促进犬移植静脉中α-平滑肌肌动蛋白的表达(分别与犬正常颈外静脉和生理盐水组比较,P < 0.001);2.应用胰岛素后明显抑制犬移植静脉中/内膜的细胞增殖(细胞增殖指数11.15%±0.93%与生理盐水组的25.55%±2.02%比较,P < 0.001);3.应用胰岛素后明显促进犬移植静脉内膜eNOS的表达(分别与正常静脉组和生理盐水组比较,P < 0.05);4.胰岛素应用可减轻移植静脉新生内膜增生程度(中/内膜厚度136.51±8.97μm,与生理盐水组的185.92±8.34μm比较, P < 0.05)。结论1.再灌注期间高血糖症损伤自体移植静脉,应用胰岛素可有效保护自体移植静脉;2.胰岛素保护自体移植静脉的效应是通过PI3K-Akt信号转导途径抑制I/R后ECs和VSMCs凋亡来实现的;3.术后短期内连续应用胰岛素治疗可有效抑制自体移植静脉新生内膜过度增生;4.胰岛素减轻犬自体移植静脉新生内膜过度增生的效应可能有赖于抑制VSMCs的增殖和血管内皮功能的改善。