我的工作主要包含两部分内容：　　 一、AnnexinⅡ受体介导细胞凋亡的研究　　 随着人们对凋亡的认识逐渐深入，对凋亡发生的分子机制的了解也越来越透彻，但同时也发现这一过程远非原来想象的那样简单，而是包含了复杂的调控机制。尽管近几年在凋亡信号转导途径、凋亡的生化反应机制以及凋亡的基因调控等方面的研究都取得了显著的进展，但仍有许多问题迄今尚未阐明。　　 本文的研究对象人类钙磷脂结合蛋白Ⅱ受体humanAnnexinⅡreceptor(简称AXIIR)，又称为C50rf39，是一个具有193个氨基酸的蛋白质，其编码基因位于人类染色体5p12区。通过基因序列比对和PCR检测认为AXIIR仅存在于人类第5号染色体上而不存在于其他种属，是人类所特有的基因。AXIIR最先是在2006年，研究者从人类骨髓cDNA文库中寻找AnnexinⅡ的受体时被克隆出来的，推测为Ⅰ型膜蛋白，研究认为AXIIR表达在骨髓基质细胞的表面，介导AnnexinⅡ的信号传导而促进成骨细胞形成。而随后对于该基因的功能研究结果也仅仅是认为其作为AnnexinⅡ的细胞膜受体来介导AnnexinⅡ的信号传递。该基因的功能研究还处于早期阶段，更没有任何证据证明其与细胞凋亡相关。　　 AnnexinⅡ是钙磷脂结合蛋白(Annexin)家族中的一个重要成员，存在于细胞膜、胞质和胞外。AnnexinⅡ具有广泛的功能，AnnexinⅡ与一系列细胞外基质成分相互作用，参与许多细胞膜相关事件，如细胞外吐和内吞，细胞黏附，纤溶酶原激活，肿瘤迁移和侵袭。　　 在本研究中，首先通过在人髓性白血病K562细胞系中过表达AXIIR基因，确证该基因高表达时能够诱导细胞凋亡。进一步发现AXIIR能引起其他人类细胞发生不同程度的凋亡，但细胞死亡比例均低于K562细胞，说明AXIIR诱导人类细胞凋亡存在一定的普遍性，但也与特定细胞类型有关。　　 在目前的文献报道中，AXIIR均是作为AnnexinⅡ的细胞膜受体来介导AnnexinⅡ的信号传递，所以我们需要了解AXIIR的诱导细胞凋亡功能是否由AnnexinⅡ信号引起。首先，我们通过免疫荧光染色方法定位AXIIR-myc分布在细胞浆中。另外，蛋白酶体抑制剂MG132处理并未增加AXIIR的蛋白水平，这也排除了胞浆内的AXIIR在被溶酶体和泛素化降解的可能性。AnnexinⅡ在一个广泛的浓度范围内并不能影响AXIIR诱导的细胞凋亡作用，说明AXIIR并不是作为AnnexinⅡ的受体来诱导凋亡的。　　 为了了解AXIIR诱导细胞凋亡的机制，我们检测了凋亡通路相关蛋白的表达量和活性，主要包括几种caspase和Bcq-2家族成员Bcq-2和BCL-XL。在AXIIR引起的细胞凋亡过程中，Caspase8,3均被激活。Caspase8抑制剂的使用也证实了Caspase8在AXIIR诱导细胞凋亡功能中发挥的重要作用。而随后的免疫沉淀实验表明AXIIR结合并激活pro-Caspase8，却并不依赖于FADD。此外，下调FADD的表达并不会影响AXIIR激活Caspase8的能力。另外AXIIR截短体表达实验说明Caspase8的羧基端对于Caspase8的激活是必需的，当然氨基端也发挥了一定作用。再者，在死亡受体诱导形成的DISC中并未检查到AXIIR的表达，说明AXIIR没有参与死亡受体诱导的Caspase8激活。　　 在我们的研究中，AXIIR不仅激活Caspase8，也同时激活了Caspase9和下调了BCL-2和BCL-XL的蛋白水平，而Bax水平无变化。BCL-XL高表达阻断线粒体途径对AXIIR诱导的细胞凋亡没有影响。这说明线粒体途径在AXIIR诱导的细胞凋亡中并不是必需的，激活的Caspase8足以直接激活Caspase3引起凋亡。　　 我们进一步分析了AXIIR在不同细胞类型中的表达水平，发现AXIIR的mRNA很容易被检测到，而蛋白却几乎不能够检测到。提示我们：AXIIR从mRNA到蛋白的翻译过程受到严格调控。研究进一步发现AXIIR翻译抑制是受其5’UTR区的调控。虽然我们尝试用几种死亡受体的配体、抗癌药和紫外线照射的方法来找到可以使AXIIR的翻译被激活的信号，但是并没有获得成功，这仍然需要进一步研究。　　 综上所述，我们发现了AXIIR除了作为细胞表面受体介导信号以外，还分布在细胞浆中，并主要通过激活Caspase8来诱导细胞凋亡。我们的研究揭示了AXIIR的新功能和激活Caspase8的一种新的方式，为对凋亡发生的分子机制的研究提供了新的线索。　　 二、Tmed2促进小鼠前成骨细胞增殖功能研究 我们实验室通过对随机siRNA文库的筛选得到了一些与小鼠MC3T3-El前成骨细胞增殖相关的基因。我们通过基因上调和下调的方法对Tmed2基因促进MC3T3-E1细胞增殖的功能进行了验证。通过MTS、细胞周期分布检测、相关周期蛋白表达水平检测等方法证明该基因通过上调CyclinA的表达水平,增高MC3T3-E1细胞S期比例,从而促进MC3T3-E1细胞增殖加快。此外,MC3T3-E1细胞在雌激素作用下增殖加快,此时Tmed2表达水平增加,提示该基因可能参与雌激素促进MC3T3-E1细胞增殖的作用。 此发现将为细胞增殖机制的研究提供新的资料。