随着对虾人工养殖集约化的发展，对虾病毒病日益频繁爆发，对虾细胞系是分离和纯化对虾病毒、研究病毒的致病机理、发展有效的诊断试剂和防控技术以及生产高效的病毒疫苗等的有利工具和研究手段。尽管国内外专家学者在对虾细胞的体外培养和建系上进行了大量的探索和不懈的努力，但目前对虾的细胞培养仍然处于原代培养水平，永生性的细胞系一直未成功建立。因此，改进现有对虾原代培养技术，建立成熟高效的对虾原代培养技术，从而能够稳定获得大量原代培养的对虾细胞单层，以及探索和建立有效的对虾细胞传代培养技术和基因转移技术，对于对虾细胞的永生性转化研究，以及最终成功建立对虾永生性细胞系都是至关重要的。本文首先在分析总结前人研究结果的基础上，设计了3种分别以0.2×L-15(I)、2×L-15(Ⅱ)和1.5×L-15(Ⅲ)培养基为基础的新的对虾培养基，以刀额新对虾（Metapenaeus ensis）的淋巴器官（又叫Oka器官）为材料，通过比较和验证以上3种培养基的培养效果，并结合对虾淋巴器官无菌制备技术，建立了成熟的对虾淋巴器官原代细胞培养系统。结果表明，通过观察对虾细胞从组织块迁出的起始时间、细胞单层达到70%~80%的汇合度所需时间、细胞寿命和生长状态，我们发现，在3种对虾培养基中，以1.5×L-15为基础并添加15%FBS、10%虾肌提取液、5g·L-1NaCl、2g·L-1葡萄糖、20ng·mL-1生长因子、10μg·mL-1氨基酸、100IU·mL-1双抗等配制的对虾培养基Ⅲ，渗透压为621±20mOsm·kg-1，pH为7.3~7.5，培养刀额新对虾的淋巴组织细胞时效果最好。细胞从组织块中迁出的时间最早（可在组织块接种后2~3小时开始迁出）；细胞迁出最快，细胞单层达到70%~80%的汇合度所需时间最短（约为组织块接种后16~24小时）；细胞贴壁紧，状态好，寿命长（28(±3)天）。我们还发现，采用对虾培养基Ⅲ可支持对虾淋巴组织块重复贴壁后细胞的迁出和存活，提高了对虾淋巴组织块的利用率，从而可以更快地获得较多的对虾原代培养细胞。同时，本文还检测了在对虾培养基Ⅲ中生长的对虾原代培养淋巴细胞对对虾白斑病毒（WSSV）的敏感性。结果发现，4×10~7、4×10~6和4×10~5个/μL滴度的WSSV病毒液接种对虾淋巴细胞2天后出现明显的细胞病变效应（cytopathiceffect, CPE），5天后，大多数WSSV感染细胞开始变圆、悬浮或死亡。而接种4×10~4个/μL滴度以及更低滴度的WSSV病毒液、灭活WSSV病毒液和PBS溶液的对虾细胞都没有出现明显的CPE。以上结果说明，采用对虾培养基Ⅲ培养的对虾原代培养淋巴细胞对WSSV具有敏感性，可用于该病毒的相关研究。其次，为找到对虾淋巴组织原代培养细胞单层的有效传代方法，本文设计并比较了13种传代方法的传代培养效果，其中包括基于8种消化液的9种消化方法：胰蛋白酶、胶原酶Ⅱ、中性蛋白酶、链霉蛋白酶E、透明质酸酶、弹性蛋白酶、 HyQTase、 ECDS (Enzyme-free Cell Dissociation Solution)和HyQTase/ECDS混合酶消化法，2种物理方法：冷PBS（4℃）处理和细胞刮刮洗，以及消化液和物理方法相结合的2种传代方法: HyQTase和ECDS分别与4℃PBS处理相结合。通过比较消化时细胞的脱壁率、消化时间、传代后细胞的形态和再贴壁率等，我们发现非哺乳动物来源的消化酶HyQTase和非酶细胞消化液ECDS表现出较好的消化效果。HyQTase原液作用于细胞单层6分钟可以将80%~89%的细胞从培养皿上消化下来，细胞的再贴壁率可达49.5±1.5%，但是稀释后的HyQTase（50%and25%原液）作用8~10mins仍表现为较低的细胞脱壁率（60%~69%）和再贴壁率（31.7±3.8%和25.6±4.0%）。ECDS消化液得到了相似的消化效果。ECDS原液消化时的细胞脱壁率和再贴壁率（80%~89%；50.3±2.7%）明显高于其两种稀释液（50%和25%）消化时细胞的脱壁率（60%~69%）和再贴壁率（35..5±5.0%和28.0±1.5%）。尽管4℃PBS单独使用时其消化效果并不明显，但是当其与HyQTase和ECDS原液溶液结合使用时，HyQTase和ECDS消化效果得到显著的提高，消化时间也都由原来的6分钟缩短为4.5分钟，细胞的脱壁率达到90%~100%，细胞的再贴壁率也明显提高，HyQTase为54.1±2.0%，ECDS为60.2±4.9%。我们还发现，常用的0.25%胰蛋白酶溶液可以很轻松地将对虾细胞从培养皿上消化下来，但是消化下来的细胞难以贴壁，大量死亡。然而，当胰蛋白酶溶液浓度降为0.125%时，在细胞脱壁率为80%~90%条件下，对虾细胞的再贴壁率明显提高，可达45.7±1.0%。但是，更低浓度的胰蛋白酶溶液（0.05%）需要更长的消化时间（10分钟），细胞的脱壁率才能达到60%~69%，而细胞的再贴壁率也相对较低（21.0±2.0%）。其它五种消化酶溶液包括胶原酶Ⅱ、中性蛋白酶、透明质酸酶、链霉蛋白酶E和弹性蛋白酶的消化效果很差，消化时间都相对较长（20~35分钟），细胞的脱壁率大约为60%~79%，细胞的再贴壁率大都在10%~20%之间，只有1mg·mL-1的胶原酶Ⅱ的贴壁率较好，可达36.2±7.3%。4℃PBS冷处理和细胞刮刮洗法单独使用时，传代效果都较差，细胞的再贴壁率都约为25%左右。由于体外培养对虾淋巴细胞无明显的增殖现象，因而传代使得培养细胞的密度不断降低。因此，目前采用HyQTase和ECDS分别与4℃PBS处理相结合的消化方法仅能将对虾淋巴组织原代培养细胞连续传代2次，此后细胞开始退化、脱壁甚至死亡。最后，本文探索了对虾淋巴细胞的基因转移技术。脂质体转染法和逆转录病毒介导法都可以将外源基因导入细胞，是构建转基因细胞常用的方法。c-Myc基因是诱导哺乳动物体细胞重编程为iPS细胞的4个转录因子之一，是调控细胞生长增殖和永生性转化的重要基因。本文采用脂质体转染法和逆转录病毒介导法分别将鼠源c-Myc基因导入对虾淋巴组织原代培养细胞中，并分别提取转染pMXs-c-Myc质粒或接种含c-Myc基因的逆转录病毒4天后的对虾细胞基因组和总RNA，然后以c-Myc基因的特异性引物进行PCR扩增，以检测c-Myc基因的整合与表达情况。结果发现，（1）脂质体转染法可以将c-Myc基因导入到对虾淋巴组织原代培养细胞中，但是不能检测到c-Myc基因的转录表达。这可能是由于表达质粒pMXs-c-Myc的启动子为细胞肥大病毒启动子CMV，在对虾细胞中不能有效转录表达。（2）逆转录病毒介导法没有成功将c-Myc基因导入到对虾淋巴细胞中，也没有检测到c-Myc基因的转录表达。这可能是由于对虾细胞缺乏哺乳动物逆转录病毒的受体，因而不能介导逆转录病毒在对虾细胞中的侵染和转移所致。为了验证以上结论，本文还采用脂质体转染法和逆转录病毒介导法分别将报告基因质粒pMCs-GFP导入对虾淋巴组织原代培养细胞中，以观察GFP的表达情况。结果发现，（1）未转染GFP基因的对照组中，接种后的对虾淋巴组织块在荧光显微镜下有明显的绿色本底荧光，而迁移生长出来的淋巴细胞在培养的前4天内观察不到明显的绿色荧光，第5天开始出现微弱的绿色本底荧光，并在随后的培养过程中一直存在。因此，在对虾细胞的转GFP基因实验中，荧光观察的时间要在前4天进行，之后，则要考虑本底荧光的亮度。（2）脂质体转染和逆转录病毒感染组的对虾淋巴组织原代培养细胞中，未观察到GFP的表达。这与c-Myc基因转染的结果相一致。综上所述，本文以1.5×L-15为基础培养基并添加一定的营养成分配制的对虾培养基Ⅲ可以成功获得状态好、迁出快、寿命长且有WSSV敏感性的对虾淋巴组织原代培养细胞。HyQTase和ECDS分别与4℃PBS处理相结合的消化方法是对虾淋巴组织原代培养细胞单层的有效传代方法，并能成功传代2次。脂质体转染法可以将c-Myc基因导入到对虾淋巴组织原代培养细胞中，但是不能检测到c-Myc基因的转录表达，逆转录病毒介导法没有成功将c-Myc基因导入到对虾淋巴细胞中，也没有检测到c-Myc基因的转录表达，利用这两种方法介导报告基因GFP导入对虾细胞的实验结果与其相一致。本文的研究结果为对虾体外培养细胞的永生性转化以及成功建系打下了良好的研究基础。