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第一部分脐带间充质干细胞来源细胞外囊泡（MSC-EVs）的生物学特征目的:脐带间充质干细胞（MSCs）具有比成人MSCs更加原始、自我更新和增殖能力更强的独特优势。细胞外囊泡（EVs）是细胞间信息传递及功能调控的重要载体,MSCs所分泌EVs被认为是MSCs发挥多种生物学效应的关键“效应器”。我们分离获取脐带MSC-EVs,对其一般特征及内含分泌型mi RNAs表达规律及功能指向进行研究,并与成人骨髓MSC-EVs对比分析,以期进一步明确脐带MSC-EVs的生物学特征,为深入研究其临床转化应用潜能提供基础。方法:收集脐带MSCs培养上清,采用差速离心法分离提取脐带MSC-EVs;通过透射电子显微镜观察脐带MSC-EVs的形态和结构;利用NTA纳米粒子追踪系统检测脐带MSC-EVs的尺寸分布,同时通过Western Blot检测其蛋白标志物的表达;提取脐带MSC-EVs和成人骨髓MSC-EVs的RNA,通过small RNA-seq检测MSC-EVs中mi RNAs的表达情况;利用mi Rtarbase和mi Randa等数据库对脐带MSC-EVs中mi RNAs的靶基因进行预测,通过KEGG富集分析其所参与的生物学过程;比较脐带MSC-EVs和成人骨髓MSC-EVs中mi RNAs表达谱的差异,分析脐带MSC-EVs中mi RNAs的富集规律。结果:我们分离获取的脐带MSC-EVs,经检测发现其为直径介于100-1000nm的具有脂质双分子层的小囊泡结构,并且表达EVs标志蛋白TSG101、CD9、Alix和β-actin,符合国内外文献对EVs的定义。small RNA-seq的结果表明,与成人骨髓MSCEVs相比,脐带MSC-EVs中有53种mi RNAs呈现上调的趋势,26种mi RNAs呈现下调的趋势;KEGG富集分析的结果显示,脐带MSC-EVs中mi RNAs的靶基因主要富集于细胞衰老、氧化磷酸化以及DNA复制等生物学进程;进一步结合文献,对脐带MSC-EVs和成人骨髓MSC-EVs差异表达的mi RNAs进行分析,发现脐带MSCEVs中高表达多种抑制细胞衰老的mi RNAs,如mi R-106,mi R-93-5p和mi R-17-5p等;同时,具有促进细胞衰老的mi R-127-3p和mi R-125b-5p等表达则普遍下调;此外,脐带MSC-EVs中还高表达抑制炎症和细胞凋亡的mi R-21和mi R-500a-3p等。结论:脐带MSCs能够分泌大量的EVs,所分泌的EVs是具有双层膜结构、且呈异质性的球状小体;与成人骨髓MSC-EVs相比,脐带MSC-EVs携带更为丰富的mi RNAs分子信息,且高表达多种具有抑制细胞衰老功能的mi RNAs,而多种促进细胞衰老的mi RNAs表达下调。提示脐带MSC-EVs选择性富集衰老相关分泌型mi RNAs,极有可能在细胞衰老信息传递及衰老表型调控中具有重要作用。第二部分脐带MSC-EVs对自然衰老小鼠组织器官退行性变的影响目的:随年龄增长机体不可避免地发生衰老及出现组织器官退行性变,而MSCs衰老与机体衰老及多组织器官退行性变密切相关。结合课题组前期体外研究发现脐带MSC-EVs可有效逆转成人骨髓MSCs衰老,我们推测脐带MSC-EVs具有延缓甚或逆转机体组织器官退行性变的体内效应。本部分以自然衰老小鼠为对象,研究脐带MSCEVs的体内应用,观察其对衰老相关分泌表型、抗氧化能力以及各种组织器官退行性变的影响。方法:将分离提取的脐带MSC-EVs以尾静脉注射的方式注入自然衰老小鼠体内,每周注射3次,连续注射4周,记录小鼠的基本健康状况;活体成像系统及激光共聚焦显微镜观察脐带MSC-EVs在自然衰老小鼠体内的分布情况;流式细胞仪检测小鼠外周血细胞及骨髓细胞对脐带MSC-EVs的摄取情况;ELISA法及偶联酶法检测小鼠血浆中SASP、氧化酶的水平;X射线检测小鼠的脊柱弯曲度;采用micro CT检测小鼠骨质的变化;获取小鼠的股骨石蜡切片观察小鼠的骨小梁面积、破骨细胞数及骨桥蛋白OPN的表达;ELISA法检测小鼠肾功能损伤指标Cr、BUN、胱抑素C及NGAL的含量;流式细胞仪检测小鼠外周血CD3+CD4+T/CD3+CD8+T比例;通过抓力、转棒式疲劳及爬杆试验检测小鼠的运动能力;同时获取小鼠的心脏、肝等其他组织器官,HE染色观察脐带MSC-EVs对各组织结构的影响。结果:脐带MSC-EVs能够进入小鼠的肝脏、脾脏、肺及骨髓等多种组织器官,并可被外周血细胞和骨髓细胞所摄取。脐带MSC-EVs连续尾静脉注射4周后,可以显著降低衰老小鼠血浆中衰老相关分泌表型IL-1α和IL-1β的水平,增强抗氧化酶CAT的表达,而降低脂质过氧化产物MDA的含量（P<0.05）。同时,经脐带MSC-EVs处理后,观察到衰老小鼠的多种组织器官的退行性变得到改善:可以提高衰老小鼠的骨参数BS/TV、BV/TV和Tb.N,减少破骨细胞数目并增强骨桥蛋白OPN的表达;降低小鼠血浆中肾功能损伤指标Cr、BUN、Cys C及NGAL的水平;显著增加外周血中CD3+CD4+T/CD3+CD8+T淋巴细胞的比例以及血管中层单位面积细胞核的数目（P<0.05）。结论:脐带MSC-EVs能够被自然衰老小鼠的多种组织器官所摄取;一定间隔的体内连续应用,可以显著降低自然衰老小鼠衰老相关分泌表型的水平,增强其抗氧化能力;更为重要的是,自然衰老小鼠的骨质、肾脏、免疫及血管等多个组织器官的退行性变得到明显改善。基于脐带MSC-EVs临床应用的安全性,提示其可能是延缓机体多组织器官退行性变的安全且有效的新手段。第三部分脐带MSC-EVs延缓自然衰老小鼠肾脏退行性变及机制初探目的:增龄性肾脏退行性变包括肾脏结构的改变和代谢功能的下降,严重影响老年人健康,但目前尚无安全有效的延缓或逆转手段。在上述小鼠体内实验中,我们发现脐带MSC-EVs可明显改善衰老小鼠的肾脏功能。为更好地将脐带MSC-EVs转化应用于延缓年龄相关的肾脏退行性变,我们进一步从组织结构、细胞及分子等层面系统观察脐带MSC-EVs对自然衰老小鼠肾脏退行性变的延缓作用,并对其可能机制作初步探讨。方法:将脐带MSC-EVs尾静脉注射到自然衰老小鼠体内,连续注射4周后获取肾脏组织,HE染色检测肾小管萎缩及肾小球扩张改变;Masson染色、TUNEL染色及Bcl-2免疫组化检测脐带MSC-EVs对衰老小鼠肾间质纤维化及肾脏细胞凋亡的影响;q PCR及Western Blot检测脐带MSC-EVs对衰老小鼠肾组织衰老相关分泌表型（IL-1α,IL-1β、IL-6）以及衰老相关基因（P16、P21、P53）表达的影响;体外培养衰老肾小管上皮细胞（HK-2）,给予脐带MSC-EVs处理,检测脐带MSC-EVs对HK-2细胞衰老状态的影响,采用CCK8及流式细胞术检测脐带MSC-EVs处理后衰老HK-2增殖、凋亡情况,同时检测其衰老相关基因（P16、P21、P53）和凋亡相关基因（Bax、Caspase 3）m RNA和蛋白水平的表达。结果:脐带MSC-EVs能够显著减小自然衰老小鼠的肾小球面积、降低肾小管萎缩程度并改善其纤维化水平。脐带MSC-EVs处理后,衰老小鼠肾脏组织中细胞的凋亡率（P<0.001）以及肾组织衰老相关分泌表型的特征因子（IL-1α,IL-1β和IL-6）、衰老标志分子（P16、P21、P53）的表达水平明显降低;此外,肾脏组织中促凋亡（Bax、Cleaved-caspase 3）和促纤维化（Vimentin、αSMA）标志物表达水平下调,而抗凋亡（Bcl-2）和抑制纤维化（E-cadherin）的标志物表达明显上调。体外实验表明,脐带MSC-EVs能够促进衰老HK-2细胞的增殖,抑制其凋亡,并能够降低HK-2细胞中衰老相关基因（P16、P21、P53）和凋亡相关基因（Bax、Caspase 3）的表达。结论:体内应用脐带MSC-EVs,能够从器官组织结构、细胞及分子等层面明显延缓自然衰老小鼠的肾脏退行性变;同时,体外研究初步发现脐带MSC-EVs具有逆转肾小管上皮细胞衰老的效应。提示脐带MSC-EVs是延缓年龄相关肾脏退行性变的新型有效手段;其机制可能与其逆转肾小管上皮细胞衰老有关,但尚需深入研究。