微管是细胞骨架的重要组成部分,它在维持细胞形状、信号转导、有丝分裂和染色体分离方面起着重要的作用。这是微管蛋白作为抗肿瘤靶点的一个重要原因。根据微管蛋白抑制剂干扰微管动力学作用机制不同,可以将其简单分为微管蛋白聚合稳定剂和微管蛋白聚合抑制剂。根据近十年报道的微管蛋白聚合抑制剂以及本课题组的研究平台,借助分子模拟计算技术,构建微管蛋白抑制剂小分子筛选数据库,然后基于组合化学的原理,设计、合成并测试其生物活性。(1)设计、合成了一系列含有1,3-苯并二氧环戊烷的吡唑啉类衍生物(A1-A33)作为潜在的微管蛋白聚合抑制剂并测试其生物活性。结果表明,化合物A4展现了最好的抑制微管蛋白聚合活性(IC50=1.88μM),并且对三株细胞A549,MCF-7和HepG-2表现出很好的抗增殖能力(依次为IC50=0.07μM,0.05μM,0.03μM),其活性与阳性对照药CA-4相当。接下来用细胞流式分析仪测试了化合物A4对HepG2凋亡及周期的影响,随着加药浓度的提高,化合物A4最终将HepG2阻滞在G2/M期。(2)根据化合物(A1-A33)的构效关系研究分析,设计合成一系列含吲哚片段的吡唑啉类衍生物作为潜在的微管蛋白聚合抑制剂(C1-C25),并测试其生物活性。对人肾上皮细胞低毒的化合物C24表现出最强的抑制微管蛋白聚合活性,其IC50值为1.6μM,抗A549,MCF-7和HepG-2三株细胞株的增殖能力的IC50值依次为0.09μM,0.59μM,0.029μM。细胞凋亡实验和细胞周期实验佐证了化合物C24能够引起细胞凋亡,并使细胞周期停留在G2/M期。C24对HepG2细胞的体外免疫荧光实验能更直观的表现出C24对微管蛋白及细胞骨架产生影响。此外,分子对接的结果表明,化合物C24与微管蛋白的秋水仙素作用位点处的的氨基酸残基存在几个相互作用力,可能在活性中起了重要作用。NO是一种分子小、结构简单、易扩散、极不稳定的生物自由基,在人体内充当第二信使。NO是由一氧化氮合酶(NOS)催化产生的,在哺乳动物里主要有三种亚型：(1)诱导型NOS (iNOS);(2)内皮型NOS (eNOS);(3)神经元型NOS(nNOS),它可以调节神经递质的释放和参与神经元的交流。过量表达的nNOS被报道与神经退行性疾病有关,例如帕金森氏、阿尔茨海默氏症、亨延顿氏疾病以及肌萎缩性侧索硬化症。所以神经元一氧化氮合酶(nNOS)是一个重要的治疗神经退行性疾病的靶点。设计nNOS抑制剂的主要的挑战是其对human nNOS抑制活性低和对其它NOS亚型选择性差等问题。该论文报道的人类nNOS选择性抑制剂是以2-aminopyridine为骨架以pyridine为linker。氢谱、碳谱、Mass等确定化合物结构后,HPLC测试化合物纯度超过95%。所有设计合成的化合物均测定了对动物NOS (rat nNOS, murine iNOS和bovine eNOS)的抑制活性和选择性,部分化合物测定了human nNOS和human eNOS的抑制活性和选择性来评估其活性和选择性。培养和测定了大部分化合物与NOS的蛋白晶体。在该研究中化合物D9是最有潜力成为human nNOS抑制剂,不但对rat nNOS表现出最强的抑制活性(Ki=16 nM),其选择性是n/i的116倍和n/e的809倍,还对人的nNOS也展现了非常好的抑制活性(Ki=13 nM),其选择性是human n/e的1831。研究化合物D9与人NOS和鼠的NOS蛋白晶体结合模式发现,中间Pyridine liker与结合口袋处的氨基酸残基形成的H-bond数目不同(两个H-bond in human:Tyr567和Tyr593;一个H-bond in rat:Tyr562)。化合物D9在人类肝微粒体代谢中表现出较好的稳定性及与血浆蛋白的低结合力和cytochromes P450的弱结合能力。