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目的:体外提取人脐带间充质干细胞源性微囊泡(human umbilical cord mesenchymal stem cells derived microvesicles,hUCMSCs-MVs)并观察hUCMSCs-MVs对糖尿病大鼠糖尿病视网膜神经损伤(diabetic retinal neurodegeneration,DRN)的作用及机制。方法:本实验分3部分,第1部分进行hUCMSCs传代培养,收集细胞培养上清液,利用超速离心法提取hUCMSCs-MVs,流式细胞仪、透射电镜等研究方法对hUCMSCs-MVs进行形态学及免疫学表型鉴定;第2部分为体外实验,实验分为4组:A组为正常对照组,B组高糖培养组(RGCs培养基内含浓度为33 mmol/L葡萄糖),C组为正常RGCs与hUCMSC-MVs共培养组,D组为高糖环境下RGCs与hUCMSC-MVs共培养组。通过免疫抗体包被筛选法及免疫荧光双染法对原代SD大鼠视网膜视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells,RGCs)进行分离及鉴定,观察hUCMSCs-MVs与RGCs的内化过程,CCK-8法、膜联蛋白-碘化丙啶(AnnexinV-PI)法、实时定量反转录聚合酶链反应(quantitative real time time-reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)、免疫印迹试验(Western Blot,WB)等测定hUCMSCs-MVs对各组RGCs的活性及凋亡的影响及各组细胞内B-细胞淋巴瘤/白血病-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)、Bax、半胱天冬蛋白酶(Caspase)-3基因水平及蛋白水平的相对表达量;第3部分为体内实验,实验分为4组:A组为正常对照组、B组为DM对照组、C组为正常对照+hUCMSCs-MVs玻璃体腔注射组、D组为DM+hUCMSCs-MVs玻璃体腔注射组。实验方法为腹腔注射链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)诱导糖尿病(diabetes mellitus,DM)大鼠模型,建模成功后8周各组行玻璃体腔内注射hUCMSCs-MVs,注射后观察时间为4周。利用苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色观察内层视网膜结构改变,原位末端转移酶标记技术(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick end labeling assay,TUNEL)观察DR大鼠内层视网膜细胞凋亡情况,免疫荧光双染法定性及定位磷酸化的c-Jun氨基末端激酶(p-c-Jun N-terminal kinase,p-JNK)在视网膜内的表达情况,WB法测量目的蛋白JNK、p-JNK、c-Jun、p-c-Jun、Bcl-2、Bax、裂解Caspase-3(Cleaved Caspase-3)的相对表达量。结果:成功提取hUCMSCs-MVs,通过透射电子显微镜及流式细胞仪对hUCMSCs-MVs进行形态及免疫学鉴定,观察到hUCMSCs-MVs直径介于10~2-10~3nm,为圆形膜性囊泡样结构,高表达hUCMSCs特异性蛋白CD44、CD29、CD73、CD105,阴性表达整合素(integrin,CD49f)、HLA class II(HLA-DR)及造血干细胞特异标记蛋白CD34、CD45。hUCMSCs-MVs的分泌效率为接种密度约1×10~5/ml、第2代-第4代(P2-P4)hUCMSCs培养上清液约300ml可提取蛋白质量约342.65?1.32μg的hUCMSCs-MVs。成功完成原代SD大鼠RGCs体外培养及鉴定,证明体外RGCs可与hUCMSCs-MVs良好内化。CCK-8及AnnexinV/PI双染法检测结果显示,B组细胞活性低于A、C、D组,B组细胞凋亡率高于A、C、D组,差异均有统计学意义(P<0.05)。RT-PCR及WB检测结果显示,B、D组RGCs、Bcl-2、Bax、Caspase-3 mRNA和蛋白相对表达量高于A、C组,差异有统计学意义(P<0.05),SNK-q组间比较结果显示D组RGCs内Bcl-2 mRNA和蛋白相对表达量高于B组,B组Bax、Caspase-3及Cleaved-Caspase-3 mRNA和蛋白相对表达量高于D组,差异均具有统计学意义。STZ诱导建立DM大鼠模型,建模成功8周后大鼠视网膜切片HE染色可见糖尿病性视网膜病变;玻璃体腔注射hUCMSCs-MVs后4周,观察4组大鼠内层视网膜厚度改变,4组差异具有统计学意义(P<0.05),SNK-q检验示B组内层视网膜厚度低于其余3组,D组视网膜厚度高于B组。4组大鼠内层视网膜TUNEL染色阳性(TUNEL~+)细胞表达率差异具有统计学意义(P<0.05),SNK-q检验分析结果显示B组大鼠内层视网膜内TUNEL~+细胞表达率高于其余各组,D组内层视网膜内TUNEL~+细胞表达率低于B组。免疫荧光定位结果显示早期DR大鼠视网膜内JNK的活化主要内层视网膜GCL,merge荧光融合后可见表达于RGCs胞浆内。4组间视网膜p-JNK阳性(p-JNK~+)表达率差异具有统计学意义(P<0.05),SNK-q检验结果显示B组大鼠内层视网膜内p-JNK~+表达率高于其余各组,D组GCL内的p-JNK~+表达率低于B组。WB结果显示4组间目标蛋白相对表达量差异均具有统计学意义(P<0.05),SNK-q检验结果显示B组Bcl-2相对表达量低于其余3组,B组JNK、p-JNK、c-Jun、p-c-Jun、Bax、Cleaved Caspase-3相对表达量高于其余3组,D组JNK、p-JNK、c-Jun、p-c-Jun、Bax、Cleaved Caspase-3相对表达量高于D组。结论:体外hUCMSCs-MVs可通过降低高糖环境下RGCs凋亡相关蛋白的表达发挥对高糖环境下RGCs损伤的保护作用;玻璃体腔注射hUCMSCs-MVs可通过增加视网膜内Bcl-2表达、降低JNK/Bax/Caspase-3的表达及活化,降低早期DR大鼠RGCs凋亡及内层视网膜萎缩,发挥对DRN的保护作用。