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研究背景牙周病(periodontal disease)是目前世界公认的受局部因素和全身因素相互促进、相互拮抗而产生的一类机制复杂的多因素疾病。慢性牙周炎(chronic periodontitis)是其中最常见的一类,其典型症状表现为牙龈的炎症和出血,牙周袋的形成,牙槽骨的吸收、以及最终牙齿的松动和脱落。口腔牙龈上皮作为抵御外界细菌感染的第一道屏障,维持着牙龈组织的健康和机体的平衡。健康的牙龈上皮可分为三部分：口腔上皮,龈沟上皮和结合上皮。非角化的龈沟生皮和结合上皮作为第一道屏障与龈沟内细菌紧密接触。牙龈的上皮细胞可以通过感受病理识别受体的刺激,释放前炎症因子、细胞因子和防御素,进而破坏上皮紧密连接结构而向深部移行形成深沟或深袋,最终形成牙周袋。这些变化通常是受感染上皮的不同细菌产物,特别是牙龈卟啉单胞菌的作用造成的,其内的微生物膜释放的细菌产物可以破坏宿主的免疫反应。在众多的多蛋白炎性复合物中，炎症复合小体在天然免疫中占有重要作用,这类复合体由NLR家族成员组成,包括3个亚类,NODs, NLRPs, IPAP,在这几个亚类中,NLRP3炎症复合物是目前研究最多的一类。NLRP3炎症复合物由NLRP3, ASC,Caspase-1组成,激活后释放IL-1β,IL-18前炎症因子,这是在宿主防御和感染中反应最为明显的两个因子。本研究中,我们将探讨牙龈上皮细胞系在不同因素刺激作用下NLRP3炎症复合物的反应机制及口腔牙龈上皮细胞紧密连接与炎症反应间的关系,进而为有效的控制和治疗牙周病提供理论依据。方法1.样本采集：选取符合实验条件预备拔牙的牙周病患者共26名,详细记录临床及X线片资料。按照实验要求切取牙龈组织后做冰冻切片及组织染色。2.口腔上皮细胞培养实验用H413细胞系是从口腔鳞状上皮细胞癌中分离出具有复层上皮细胞形态并高表达CD24的一类细胞系。克隆细胞系培养条件是JMEM,胎牛血清和盘尼西林/链霉素的混合培养基,37℃含5%C02的孵箱。该细胞系一般3天进行一次传代。3.牙龈卟啉单胞菌培养牙龈卟啉单胞菌ATCC33277培养于专用的细菌厌氧箱中,当细菌从-80℃复苏后接种于TSB培养皿上,待生成单菌株后,挑去单颗置于eTSB(含维生素K)的培养液中,测OD值达1.0时用于实验。4.免疫组化染色和共聚焦激光扫描显微术所有切片及细胞使用免疫组化染色,共聚焦激光显微镜(Olympus FV 10-MCPSU (405nm,473nm,633nm), NTT electronic Optiλ, (559 nm)激光)观察并拍照,由两个观察员独立观察,标记,分类,读数并记录。所有图片用共焦采集软件(FV10-ASW1.7)处理并保存为TIF文件。5.提取细胞RNA,转录合成cDNA,实时定量RT-PCR:用Trizol提取法(Trizol regent, Invitrogen)提取细胞总RNA。用SuperscriptⅢ反转录试剂盒(Invitrogen)实时定量RT-PCR测在牙龈卟啉单胞菌感染、LPS以及ATP刺激的不同时间时细胞炎症复合物的基因表达水平以及细胞紧密连接中各种基因的表达水平的差异。6.酶联免疫吸附法检测IL-1p及IL-18的表达水平：在上述处理条件中,不同时间点(0,1,2,3,4,5,6个小时)收集细胞培养盘中的media离心取上清按照ELISA kits (Abnova, Taiwan)设计96孔盘,分析IL-1p及IL-18的蛋白表达水平。7.免疫印迹法分析蛋白表达水平：按实验设计处理细胞后,收集蛋白,加热,变性,固定,加样,跑胶,转膜,封闭,常温,过夜。一抗孵育4小时,二抗孵育2小时,终止反应后观察。8.统计分析：Prism 3.03软件进行统计分析。P<0.05具有统计学差异。结果：1.牙周活组织检查中NLRP3和occludin的表达分布健侧和患侧的龈沟上皮以及健侧和患侧的袋内上皮之间NLRP3的表达有显著性差异。健侧牙龈的龈沟上皮和结合上皮与患侧袋内上皮之间occludin有显著性差异。2.Pg、LPS、ATP+Pg、ATP+LPS作用后炎症复合物的表达牙龈卟啉单胞菌刺激细胞抑制NLRP3炎性复合物的合成和释放。LPS促进NLRP3,ASC而非caspase-1的表达。ATP可以促进NLRP3炎性复合物的释放和IL-1β及IL-18细胞因子的生成。IL-1β在牙龈卟啉单胞菌作用下出现明显表达增高,而LPS对它的作用并不明显。相反,牙龈卟啉单胞菌感染并不能诱导IL-18的合成,而LPS或ATP的刺激可以诱导IL-18的合成和释放。3. Pg、LPS、ATP+Pg、ATP+LPS作用后细胞紧密连接的表达牙龈卟啉单胞菌作用后,仅出现Claudin-4的短暂升高,而Occludin、JAM-A、 Claudin-1、Claudin-15及ZO-1均表现出了明显的抑制和下调。LPS作用后,除Occludin、JAM-A、claudin-4之外,其余的蛋白均出现了明显的上调。ATP作用后Occludin、JAM-A、Claudin-1、Claudin-4、Claudin-15及ZO-1的表达一过性增强。结论：1.牙龈卟啉单胞菌完全抑制了NLRP3炎性复合物的表达过程,而且除Claudin-4外,其他发挥屏障功能的蛋白均出现失调状态。这为细菌等致病因素进一步感染细胞提供了便利。2.LPS促进NLRP3,ASC而非caspase-1的表达增强。Occludin、JAM-A和claudin-4作为第一道屏障,在受到LPS的刺激时表现出抑制作用,提示LPS在促进炎症反应过程及破坏前沿细胞屏障防御系统中具有重要作用。3.ATP促进NLRP3炎性复合物释放、细胞紧密连接蛋白表达增强和IL-1β及IL-18细胞因子的生成。这提示ATP在刺激细胞膜极性化并导致细胞膜完整性的破坏及细胞内离子浓度的变化的过程中具有重要作用。4. Cspase-1通常以非活化的酶原状态存在。在LPS刺激后并没有任何反应直到ATP活化细胞之后才释放。说明它的激活严格受到炎症复合物的调控。5.IL-1β作为天然免疫过程中最早释放的细胞因子之一,在参与激活和免疫调节过程中具有重要的作用。