目的:自身免疫甲状腺炎(Autoimmune thyroiditis,AIT)是一种常见的自身免疫性疾病,其中桥本甲状腺炎(Hashimoto thyroiditis,HT)是AIT的主要类型,主要表现为甲状腺内淋巴细胞的浸润、甲状腺滤泡细胞的损伤和血清中存在甲状腺的特异性抗体,主要是抗甲状腺过氧化物酶抗体(Antithyroid peroxidase antibodies,TPOAb)和甲状腺球蛋白抗体(Thyroglobulin antibodies,Tg Ab)。HT的发生与个体的遗传易感性、环境、免疫失衡等诸多因素有关,但其具体的发病机制尚不明确。HT的甲状腺本身或免疫系统的异常改变都可能导致免疫耐受打破,进而启动自身免疫反应。近年来,固有免疫系统被认为是连接遗传易感性与环境性危险因素的交汇点,固有免疫反应的结局决定是否进一步发展为以适应性免疫反应为主导的自身免疫损伤,Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)则被认为是先天性免疫和适应性免疫的关键枢纽,并参与多种炎症反应和自身免疫性疾病。本研究组前期在AIT患者及碘诱导的NOD.H-2h4小鼠AIT动物模型中证实辅助性T细胞1(T helper l cell,Th1)/辅助性T细胞2(T helper 2 cell,Th2)的偏移,调节性T细胞(Regulatory T cell,Treg)及辅助性T细胞17(T helper l7 cell,Th17)的比例异常和功能下降也参与AIT的发病。外泌体是细胞分泌的直径在30-100nm的一种细胞外囊泡,其内容物包括来源于母细胞的蛋白质、脂类和RNA等,这些物质能作为信号分子被外泌体传递给其他细胞从而改变其他细胞的功能。近年来大量研究发现外泌体在多种自身免疫性疾病,包括类风湿性关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)、多发性系统硬化(Multiple sclerosis,MS)、系统性红斑狼疮(Systemic lupus erythematosus,SLE)、炎症性肠病(Inflammatory bowel disease,IBD)、原发性胆汁性肝硬化(Primary biliary cirrhosis,PBC)和1型糖尿病(Type 1 diabetes mellitus,T1DM)等的发生、发展及转归过程中发挥了重要作用。本研究在HT患者和健康人,及有无干扰素-γ(Interferon-γ,IFN-γ)刺激的甲状腺滤泡细胞系中分别进行,旨在探讨是否HT患者的血清外泌体及IFN-γ刺激的甲状腺滤泡细胞释放的外泌体含有甲状腺特异性抗原(甲状腺过氧化物酶(Thyroperoxidase,TPO)和甲状腺球蛋白(Thyroglobulin,Tg))、炎症分子(热休克蛋白60(Heat shock protein 60,HSP60)和高速泳动族蛋白1(High mobility group box 1,HMGB1))及抗原递呈分子(主要组织相容性复合物II(Major histocompatibility complex class II,MHC-II)和细胞粘附分子1(Intercellular adhesion molecule 1,ICAM-1)),具有抗原呈递功能和促炎作用,可激活免疫细胞,如树突状细胞(DC,Dendritic cell)和CD4+T淋巴细胞,参与HT的发生和发展,及具体的作用通路,为HT的发病提供新的理论基础,为HT的治疗提供新思路。研究方法:第一部分---血清来源的外泌体实验:本研究收集HT患者和年龄与性别匹配的健康对照者(Healthy controls,HCs)各30例,通过超高速离心方法提取HT患者和HCs的血清外泌体,通过透射电子显微镜(Transmission electron microscopy,TEM)、纳米粒子追踪分析(Nanoparticle tracking analysis,NTA)及免疫印迹(Western blot,WB)对外泌体进行鉴定。Western blot检测HT患者的血清外泌体(HT patient serum derived exosomes,HT-exosomes)和HCs的血清外泌体(Healthy control serum derived exosomes,HC-exosomes)中TPO、Tg、HMGB1、HSP60、MHC-II和ICAM-1的表达情况。将健康人外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)或分选培养的DCs与PKH-67标记的血清外泌体共培养24h后,免疫荧光检测HT-exosomes和HC-exosomes是否可被健康人的PBMCs摄取,及是否可与DCs上的TLR2/3结合,流式细胞仪进一步检测在PBMCs中单核细胞、DCs和CD4+T淋巴细胞,哪类细胞主要摄取外泌体。将健康人的PBMCs与HT-exosomes或HC-exosomes共培养24h后,流式细胞仪检测CD11c+TLR2+、CD11c+TLR3+和CD11c+TLR4+细胞的百分比。在有无TLR2/3抑制剂的情况下,将健康人分选培养的DCs与HT-exosomes或HC-exosomes共培养24h后,Western blot检测DCs中髓样分化因子88(Myeloid differentiation factor 88,My D88)、β干扰素Toll/IL-1R结构域衔接蛋白(Toll/IL-1 receptor-domain containing adaptor-inducing interferon-β,TRIF)和磷酸化的P65(p-P65)的表达水平,流式细胞仪检测CD40、CD80和CD83的平均荧光强度,酶联免疫吸附实验(Enzyme-linked immunoabsorbant,ELISA)检测上清中白介素(Interleukin,IL)-6的表达水平。在有无TLR2/3抑制剂的情况下,将健康人的PBMCs与HT-exosomes或HC-exosomes共培养24h后,流式细胞仪检测PBMCs中CD4+IFN-γ+Th1、CD4+IL-17A+Th17A和CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞的百分比,ELISA检测上清中IFN-γ、IL-17A和IL-10的表达水平。第二部分---甲状腺滤泡细胞来源的外泌体实验:本研究收集有无IFN-γ刺激的甲状腺滤泡细胞系(Nthy-ori 3-1 cells)的上清液,通过超高速离心方法提取上清液中的外泌体,鉴定方法同第一部分。Western blot检测甲状腺滤泡细胞来源的外泌体(Nthy-ori 3-1 cell-derived exosomes,Exo)和IFN-γ刺激的甲状腺滤泡细胞来源的外泌体(IFN-γtreated Nthy-ori 3-1 cell-derived exosomes,IFN-γ-Exo)中蛋白的表达情况,指标同第一部分。将健康人分选培养的DCs与Exo或IFN-γ-Exo共培养24h后,流式细胞仪检测CD40、CD80和CD83的平均荧光强度,逆转录-聚合酶链反应(Reverse transcriotion polymerase chain reaction,RT-PCR)检测IL-6和肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor,TNF)的m RNA表达水平。在有无GW4869抑制甲状腺滤泡细胞释放外泌体的情况下,将甲状腺滤泡细胞与DCs共培养24h,流式细胞仪检测CD40、CD80和CD83的平均荧光强度,RT-PCR检测IL-6和TNF的m RNA表达水平。将DCs与Exo或IFN-γ-Exo共培养24h后,离心去除细胞上清,再与自体的CD4+T淋巴细胞共培养24h,RT-PCR检测CD4+T淋巴细胞中IFN-γ、IL-17A、IL-22、IL-4、IL-10和转化生长因子(Transforming growth factor-β1,TGF-β1)的m RNA表达水平,ELISA检测上清中IFN-γ、IL-17A和IL-10的表达水平。将健康人分选的CD4+T淋巴细胞与Exo或IFN-γ-Exo共培养24h后,RT-PCR及ELISA检测以上细胞因子的表达水平。比较IFN-γ-Exo和IFN-γ-Exo刺激的DCs(IFN-γ-Exo-stimulated dendritic cells,DCIFN-γ-Exo)对CD4+T淋巴细胞中以上细胞因子的m RNA表达水平和上清液中的蛋白表达水平的影响。结果:第一部分---血清来源的外泌体实验:1、TEM结果表明HT-exosomes为直径30-100 nm的“杯状”囊泡。NTA结果表明HT-exosomes分布均匀,主峰在95±5nm。Western blot结果证实HC-exosomes和HT-exosomes高表达外泌体标记物CD63。2、Western blot结果证实HT-exosomes中TPO、HSP60和MHC-II的蛋白表达显著高于HC-exosomes(P=0.002、0.012和0.016),并且血清外泌体中的TPO和HSP60的表达水平与血清中TPOAb和Tg Ab的滴度呈正相关(TPO与TPOAb:P=0.004;TPO与Tg Ab:P=0.022;HSP60与TPOAb:P<0.001;HSP60与Tg Ab:P<0.001)。3、免疫荧光结果显示HT-exosomes和HC-exosomes都可被PBMCs摄取,流式细胞仪结果进一步证实在PBMCs中,以CD14+单核细胞和CD11c+DCs摄取外泌体为主(P<0.001和<0.001)。4、免疫荧光结果显示HT-exosomes和HC-exosomes都可与DCs上的TLR2/3结合,流式细胞仪进一步证实HT-exosomes可增加PBMCs中CD11c+TLR2+和CD11c+TLR3+细胞的百分比(P=0.009和0.014)。5、Western blot、流式细胞分析及ELISA结果证明,与HC-exosomes相比,HT-exosomes可增加DCs中My D88、TRIF和p-P65的蛋白表达水平(P=0.003、0.006和0.003),CD40和CD83的平均荧光强度(P=0.004和0.028)和IL-6在上清液中的蛋白表达水平(P=0.026)。上述大部分结果在加入TLR2或TLR3抑制剂后可降低。6、流式细胞分析及ELISA结果证明,与HC-exosomes相比,HT-exosomes可增加PBMCs中CD4+IFN-γ+Th1和CD4+IL-17A+Th17A细胞的百分比(P=0.027和0.039)及上清液中IFN-γ和IL-17A的蛋白表达水平(P=0.035和0.008),而降低CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞的百分比(P=0.014)及上清液中IL-10的蛋白表达水平(P=0.024)。上述大部分结果在加入TLR2或TLR3抑制剂后可被逆转。第二部分---甲状腺滤泡细胞来源的外泌体实验:1、通过TEM,NTA和Western blot结果表明我们成功地从甲状腺滤泡细胞上清液中提取出了外泌体。2、Western blot结果表明TPO、HSP60和MHC-II的蛋白表达水平在IFN-γ-Exo中明显高于Exo(P=0.015、0.025和0.026)。3、流式细胞分析及RT-PCR检测证实,与Exo相比,IFN-γ-Exo显著增加了DCs上共刺激因子CD40和CD80以及成熟标记物CD83的表达水平(P=0.013、0.009和0.036),显著增加了DCs中IL-6和TNF的m RNA表达水平(P<0.001和0.026)。4、GW4869抑制IFN-γ-Exo的释放后,降低了DCs上共刺激因子CD40和CD80以及成熟标记物CD83的表达水平(P<0.001、0.017和0.045)及DCs中IL-6和TNF的m RNA表达水平(P=0.007和0.01)。5、RT-PCR及ELISA结果显示,与Exo刺激的DCs(Exo-stimulated dendritic cells,DCExo)相比,DCIFN-γ-Exo显著增加CD4+T淋巴细胞中IFN-γ和IL-17A的m RNA表达水平(P<0.001和0.002),并增加了上清液中IFN-γ和IL-17A的蛋白表达水平(P<0.001和0.03)。相反,与DCExo相比,DCIFN-γ-Exo明显降低了CD4+T淋巴细胞中IL-10和TGF-β1的m RNA表达水平(P=0.029和0.036),并降低了上清液中IL-10的蛋白表达水平(P=0.047)。6、RT-PCR及ELISA结果表明,与Exo相比,IFN-γ-Exo有促进CD4+T淋巴细胞中促炎因子的表达和释放,并抑制抑炎因子的表达和释放的倾向,但在两组之间所有炎症指标的m RNA表达水平及上清液中的蛋白表达水平均没有差异。7、RT-PCR及ELISA的结果表明,与DCIFN-γ-Exo共培养的CD4+T淋巴细胞中IFN-γ、IL-17A、IL-22、IL-4、IL-10和TGF-β1的m RNA表达水平(P=0.002、0.001、0.025、0.011、0.01和0.011)和上清液中IFN-γ、IL-17A和IL-10的蛋白表达水平(P=0.004、0.02和0.008)都明显高于与IFN-γ-Exo共培养的CD4+T淋巴细胞中以上指标的m RNA表达水平及上清液中的蛋白表达水平。结论:1、HT-exosomes和IFN-γ-Exo都高表达甲状腺特异性抗原TPO、抗原递呈分子MHC-II类分子和炎症因子HSP60。2、HT-exosomes可与DCs的TLR2/3结合,通过TLR2/My D88/NF-κB和TLR3/TRIF/NF-κB途径激活DCs,并导致CD4+T淋巴细胞的分化失衡。TLR2/3抑制剂可部分逆转上述结果。3、甲状腺细胞来源的外泌体不能直接诱导CD4+T淋巴细胞的细胞因子表达和释放,需要先激活DCs。4、外泌体抑制剂GW4869抑制IFN-γ刺激的甲状腺滤泡细胞释放的外泌体后,阻断了甲状腺滤泡细胞对DCs的活化,提示外泌体在抗原递呈炎症反应中发挥关键作用。