犬恶丝虫(Dirofilaria immitis)属旋尾目,丝虫亚目,蟠尾科,恶丝虫亚科,恶丝虫属。犬恶丝虫病是由犬恶丝虫成虫寄生于犬的右心室、肺动脉内,使患犬形成机械性栓塞,影响心肺功能,导致呼吸衰竭、循环和泌尿系统遭受严重损伤的寄生线虫病。犬、猫科动物是本病的天然宿主,野生肉食动物、马属动物、海狸、猩猩、麝鼠、灵长类等偶见感染,还可以感染人类。该病通过蚊子摄取含微丝蚴(无鞘、长锥形尾)的血液进行传播,有超过60种的蚊子可以传播该病。迄今为止,犬恶丝虫病仍没有理想的诊断和预防措施。国内外有许多犬恶丝虫病检测方法的报道,如:微丝蚴检查、血凝试验、琼脂扩散试验、补体结合试验、荧光抗体标记技术、PCR法等,但效果均不理想。目前防治该病主要依赖化学药物,尚无理想的预防疫苗。因此本研究在构建犬恶丝虫成虫cDNA文库的基础上,筛选并获得免疫相关基因。然后利用获得的免疫相关基因制备了亚单位疫苗和核酸疫苗并确定这些疫苗刺激机体产生的免疫应答。最后以纯化的重组蛋白为诊断抗原建立了犬恶丝虫病的ELISA诊断方法。从而为犬恶丝虫病的免疫预防和诊断奠定了良好基础。犬恶丝虫成虫cDNA文库构建本研究采用Clontech公司的SMART技术提取犬恶丝虫总RNA后反转录,再合成第二链cDNA,经蛋白酶K处理和Sfi酶切后进行片段分离并连接、包装构建犬恶丝虫成虫cDNA文库。结果表明:试验成功构建了犬恶丝虫成虫cDNA表达文库,原始文库的库容量为9×10~5 pfu/mL,重组率为98%,扩增文库滴度为1.0×10~9 pfu/mL,该文库的建立为进一步筛选免疫相关基因奠定了基础。犬恶丝虫免疫相关基因筛选采用SEREX技术对文库进行筛选。首先对文库中的λ噬菌体进行平板培养,然后用IPTG诱导蛋白质表达,分别采用小鼠抗犬恶丝虫高免血清和自然感染犬血清从cDNA表达文库中进行筛选,共获得11个阳性克隆。经分析它们均编码犬恶丝虫免疫相关蛋白,分别为:犬恶丝虫副肌球蛋白部分序列、犬恶丝虫强免疫反应部分序列、犬恶丝虫表皮抗原串联重复序列、马来丝虫酪蛋白激酶(Csnk2b)部分序列、犬恶丝虫中性粒细胞趋化因子前体部分序列、犬恶丝虫18S核糖体RNA基因部分序列、马来丝虫Fip1基序家族蛋白部分序列、马来丝虫解旋酶的保守C端结构域包含的蛋白质部分序列、马来丝虫肌球蛋白尾家族蛋白部分序列、马来丝虫G蛋白路径抑制剂1部分序列以及马来丝虫ATP酶,AAA家族蛋白部分序列。本研究选取其中两个新发现的犬恶丝虫新基因作为疫苗和诊断候选抗原基因,将与马来丝虫G蛋白路径抑制剂1同源基因命名为GSP1(同源性85%);与编码马来丝虫肌球蛋白尾家族蛋白同源基因命名为MTFP(同源性88%)。GSP1和MTFP基因重组亚单位疫苗研究将GSP1与MTFP基因扩增,构建重组原核表达质粒,将其分别转化至大肠埃希菌DE3内,进行IPTG诱导表达,将原核表达产物分别免疫实验动物,通过抗犬恶丝虫特异抗体、CD4~+ T和CD8~+ T淋巴细胞百分比,检测表达蛋白是否具有免疫原性。结果表明:成功构建了pGEX-4T-1-GSP1和pGEX-4T-1-MTFP重组原核表达质粒,SDS-PAGE显示表达蛋白大小分别为36Ku和34Ku,Western Blotting显示均能被自然感染犬恶丝虫的多克隆抗体识别。两个纯化的重组蛋白分别免疫BALB/c小鼠,以犬恶丝虫可溶性蛋白做检测抗原,采用ELISA法检测小鼠的体液免疫水平:试验组血清IgG滴度逐渐升高,第三次免疫后其抗体滴度与对照组相比差异均极显著(P<0.01);细胞免疫水平检测:试验组CD4~+ T淋巴细胞百分比与与佐剂和空白对照组相比均差异极显著,试验组CD8~+ T淋巴细胞百分比与佐剂和空白对照组相比均差异不显著(P>0.05),CD4~+与CD8~+ T淋巴细胞比值与佐剂和空白对照组相比均差异极显著(P<0.01)。GPS1与MTFP基因有望成为犬恶丝虫亚单位疫苗研究的候选基因,本研究为犬恶丝虫病的免疫预防奠定了基础。GSP1和MTFP基因核酸疫苗研究分别将GPS1与MTFP基因定向亚克隆到真核表达质粒pVAX1中,构建pVAX1-GPS1和pVAX1-MTFP重组真核表达质粒并转染HeLa细胞。将真核表达质粒分别免疫实验动物,通过抗犬恶丝虫特异抗体、CD4~+ T和CD8~+ T淋巴细胞百分比,检测表达蛋白是否具有免疫原性。结果表明:成功构建了pVAX1-GPS1和pVAX1-MTFP重组真核表达质粒并成功转染了HeLa细胞,Western Blotting显示表达蛋白均与预期大小相符,均能被自然感染犬恶丝虫的多克隆抗体识别。将重组质粒免疫BALB/c小鼠后,以犬恶丝虫可溶性蛋白做检测抗原,以ELISA法检测小鼠的体液免疫水平显示:试验组血清IgG显著高于佐剂和空白对照组(P<0.01);细胞免疫水平检测显示:试验组CD4~+ T淋巴细胞百分比显著高于佐剂和空白对照组(P<0.01),试验组CD8~+ T淋巴细胞百分比与佐剂和空白对照组相比均差异不显著(P>0.05),CD4~+与CD8~+ T淋巴细胞比值均显著高于佐剂和空白对照组(P<0.01)。本研究为犬恶丝虫病的免疫预防奠定了基础。犬恶丝虫病ELISA方法的建立以纯化重组蛋白GST-GSP1和GST-MTFP为诊断抗原建立犬恶丝虫病的ELISA诊断方法。采用方阵滴定试验确定最佳工作浓度,并通过进一步的特异性试验进行验证。结果表明:重组蛋白的最佳工作浓度分别为(GST-GSP1为5.5μg/100μL;GST-MTFP为5μg/100μL),最佳血清稀释倍数均为1:150,HRP标记羊抗犬IgG均稀释为1:2000。进一步的阻断性试验、交叉反应试验、敏感性试验、重复性试验、与参考阴阳性血清符合率试验及现场检测对比试验证明:该方法具有敏感性高(融合蛋白GST-GSP1检出犬恶丝虫的最高抗体滴度为1:1600;GST-MTFP为1:3200),特异性较强且稳定性好的特点。现场符合率试验结果表明:45只待检犬用犬恶丝虫抗原检测试剂盒检测的阳性率为20.0% ;采用融合蛋白ELISA法和PCR法进行检测的阳性率均为22.2%,且经剖检验证无假阳性。该方法的建立为犬恶丝虫病的诊断奠定了基础。