弓形虫自从1908年被发现以来,人们对弓形虫和弓形虫病的认识经历了一个多世纪的发展变迁。现为人们熟知的是弓形虫病可以通过母婴传播,经口传播,血液传播等。因其宿主的广泛性(几乎所有的温血动物)和传播途径的多样化,全球有三分之一的人感染弓形虫病,且每年呈增长趋势。虽然大多数免疫功能正常的人为隐形感染,但是到目前为止,仍然没有药物可以根治弓形虫病。临床上治疗弓形虫病主要依赖一些磺胺类的化学药物,而这些化学药物只针对弓形虫速殖子发挥作用,对弓形虫慢性感染没有很好的疗效。因此,抗弓形虫病疫苗的研究已成为弓形虫病研究的热点问题。弓形虫疫苗的研究经历了一个漫长的过程,从全虫疫苗到虫体特异组分疫苗阶段,到基因工程疫苗再到现在的DNA疫苗阶段。DNA疫苗的候选抗原分子多为与弓形虫毒力、入侵相关的一些因子,包括微线体、棒状体和致密颗粒等弓形虫亚细胞器分泌的抗原分子。弓形虫棒状体蛋白38 (rhoptry protein 38, TgROP38)可以调节MAPK信号转导途径,在不同基因型的弓形虫虫株中的表达量差异很大,而且在弓形虫由速殖子向缓殖子转换过程中,大多数棒状体蛋白的表达量下调,而ROP38的表达量反而上调了5倍。本论文对弓形虫ROP38基因的序列变异、蛋白特性和疫苗免疫保护作用进行了研究。本论文首先对不同宿主和地理来源的13个弓形虫虫株的ROP38基因进行聚合酶链式反应(PCR)扩增、克隆和测序。13个虫株ROP38片段长度为2646bp-2650bp,种内变异率为0.2-1.1%。用贝叶斯(Bayesian inference, BI)进行的种系发育分析显示,基于ROP38基因重构的种系发育树结果不能较好地显示弓形虫不同基因型虫株之间的遗传变异关系。其次应用生物信息学软件,预测了ROP38蛋白的生物学特性。以弓形虫RH株基因组DNA为模板,应用PCR扩增出TgROP38基因的ORF序列。测序后,将核苷酸序列翻译成氨基酸序列并利用生物信息学软件进行分析。结果表明TgROP38蛋白是跨膜蛋白,含有多个亲水区域和B细胞抗原表位。本研究还评价了ROP38核酸疫苗的免疫保护作用。首先构建pVAX-ROP38真核表达质粒,成功转染和表达于真核细胞HEK293。经DNA免疫昆明系小白鼠,同时设立pVAX I、PBS和空白三个对照组。经过3次免疫后,测定相应的体液免疫和细胞免疫指标。于三免后第14d,分别用弓形虫强毒RH株速殖子致死剂量(1000个速殖子)腹腔感染小鼠,用弓形虫弱毒Prugniaud(PRU)虫株10个包囊灌胃感染小鼠,观察其存活时间和包囊减少率。结果显示,构建的真核表达质粒pVAX-ROP38免疫昆明小鼠后,可产生高水平IgG抗体水平和IL-2和IFN-y,有效地诱导Th1型免疫应答,产生高水平的CD3+CD4-CD8+和CD3+CD4+CD8-T淋巴细胞。RH株攻击感染实验显示,与7d内死亡的三个对照组相比,免疫组不能显著延长小鼠存活时间(pVAX-ROP38,8.1d±0.75)。但与三个对照组相比,经pVAX-ROP38免疫后,小鼠的脑包囊减少率为76.6%,差异明显。本研究最后评价了rROP38和rROP18混合蛋白疫苗的免疫保护作用以及聚D,L-乳酸-co-乙醇酸(PLG)缓释颗粒的免疫增强效应。构建了PLG-rROP38和PLG-rROP18的缓释颗粒。用rROP38、PLG-rROP38、rROP18、PLG-rROP、rROP38-rROP18和PLG-rROP38-rROP18免疫昆明小鼠,同时设立PBS、PLG-PBS和空白对照3个对照组。蛋白疫苗免疫后,测定小鼠体内相应的体液免疫和细胞免疫指标,并于二免后6w,用PRU虫株10个包囊灌胃感染小鼠,观察其包囊减少率。实验结果显示, rROP38和rROP18缓释颗粒的蛋白疫苗免疫昆明小鼠后,可产生高水平抗体及抗体亚类水平、IFN-γ和IL-2含量,可有效地诱导Thl-Th2混合型细胞免疫应答,产生高水平的CD3+CD4CD8+和CD3+CD4+CD8- T淋巴细胞增殖。与对照组相比,rROP38和rROP18缓释颗粒混合疫苗组的包囊减少率高达81.26%。本研究成功扩增出弓形虫ROP38基因,发现其在不同虫株间的序列变异较低(0.2-1.1%)。TgROP38蛋白是跨膜蛋白,含有多个亲水区域和B细胞抗原表位。ROP38核酸疫苗和蛋白疫苗均对弓形虫弱毒PRU株有很好的免疫保护作用,是抗弓形虫慢性感染良好的抗原候选分子。PLG缓释剂可很好的延长疫苗在受体内的释放时间,起到了长效的作用。这些研究结果为今后研制抗弓形虫慢性感染疫苗奠定了基础。