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捻转血矛线虫（Haemonchus contortus）是一种寄生于牛、羊、骆驼等反刍动物皱胃中的吸血性寄生虫,在我国呈广泛性流行,给中国的畜牧业造成重大经济损失。抗蠕虫药物对于捻转血矛线虫病有良好的治疗效果,但近年来耐药株频繁出现,增加了该病防治的难度。线虫生命调控关键基因作为新型药物靶点的筛选及抗蠕虫药物开发是目前捻转血矛线虫病防控的重要研究方向。蜕皮是线虫生长发育过程中必经的生命过程,当该过程发生障碍时,可影响虫体的正常发育,降低活动能力,甚至导致幼虫死亡,因此探明蜕皮作用机制及相关基因的生物学功能,对于该病的防控至关重要。本研究从已公布的捻转血矛线虫转录组数据库中筛选了 3种线虫虾红素样蛋白基因（Nematode astacin,NAS）,扩增获得了 Hc-nas-5、Hc-nas-31和Hc-nas-33基因全长,并对其结构域和分子进化关系进行了预测分析;在HEK 293T细胞、秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）和捻转血矛线虫中观察了 HcNASs的表达特性;利用转录特性分析和RNA干扰试验探究了Hc-nas-33在捻转血矛线虫生长发育过程中发挥的功能;构建了捻转血矛线虫酵母cDNA文库,并筛选得到Hc-NAS-33的候选互作蛋白鸟嘌呤核苷酸结合蛋白 β 亚基-1（Guanine nucleotide-binding protein subunit beta-1,GPB-1）,验证了两者的互作关系;并对Hc-GPB-1在蜕皮过程中的功能进行了研究。实验结果为深入研究捻转血矛线虫蜕皮机制奠定了基础,同时也为新药开发提供了潜在的药物靶点。1.捻转血矛线虫HcNASs基因特性分析通过扩增获得捻转血矛线虫3个虾红素样蛋白基因Hc-nas-5、Hc-nas-31和Hc-nas-33的全长DNA及mRNA序列,利用生物信息学软件预测分析基因结构、蛋白功能和分子进化关系;并构建原核表达载体获得重组蛋白,制备多克隆抗体。实验结果表明,3个HcNASs均有典型的锌金属蛋白酶结构域,此外Hc-NAS-31还具有1个CUB结构域和1个SXC结构域,Hc-NAS-33具有1个EGF结构域和1个CUB结构域;Hc-NAS-5和Hc-NAS-31具有C端信号肽。利用pET原核表达系统成功表达了 HcNASs重组蛋白,通过免疫实验动物获得了特异性较好的多克隆抗体。本研究扩增得到3种HcNASs基因对其进行了生物信息学分析,制备了多克隆抗体,可用于后续蛋白表达特性分析。2.HcNASs表达特性分析为了全面分析HcNASs的表达特性,本研究首先通过构建真核表达载体,转染HEK293T细胞,分析其在真核细胞中的定位情况;构建异源表达质粒,通过显微注射获得重组转基因虫株,探究在秀丽隐杆线虫中的表达情况;利用制备的多克隆抗体,通过幼虫间接免疫荧光（Indirect immunofluorescence,IFA）和L4及成虫免疫组织荧光（Immunohistofluorescence,IHF）分析在捻转血矛线虫中的表达特性。实验结果显示3种HcNASs均表达于HEK 293T细胞质中;在秀丽隐杆线虫中,Hc-NAS-5只表达于咽部和尾部极少数细胞中,Hc-NAS-31不能表达,Hc-NAS-33表达于咽部与肠道内;在捻转血矛线虫中,Hc-NAS-5和Hc-NAS-31定位于L3上皮合胞体,而在成虫中Hc-NAS-5和Hc-NAS-31表达模式缺乏特异性,广泛分布于多种虫体组织,Hc-NAS-33特异性表达于肠道与肌肉接触面、子宫膜和未成熟虫卵外周。本研究明确了 HcNASs的表达特性,为后续的功能研究指明了方向。3.Hc-nas-33在捻转血矛线虫蜕皮发育过程中的功能研究为了探究Hc-nas-33是否参与捻转血矛线虫蜕皮过程,本研究利用实时荧光定量 PCR（Quantitative real time PCR,qRT-PCR）分析了Hc-nas-3在不同时段内的转录特性,同时也进行了秀丽隐杆线虫同源基因的比较性研究,其次运用RNA干扰方法探究Hc-nas-33沉默后对捻转血矛线虫生长发育的影响。转录特性分析结果显示,Hc-nas-33转录水平在捻转血矛线虫L1-L2蜕皮过程中呈振荡变化,且在中后期达到峰值,Ce-nas-33基因在蜕皮过程中同样表现振荡转录特性;RNA干扰后,幼虫正常生长发育受到严重影响,虫体出现发育迟缓、活动力下降、畸形及蜕皮功能障碍等表型。上述结果证明Hc-nas-33为捻转血矛线虫蜕皮相关基因,为后续研究捻转血矛线虫蜕皮机制、开发新药物奠定了基础。4.捻转血矛线虫酵母cDNA文库构建及Hc-nas-33互作蛋白的筛选鉴定为了进一步探索Hc-nas-33参与蜕皮过程的分子机制,本研究构建了捻转血矛线虫酵母cDNA文库,并利用酵母双杂交系统筛选与Hc-NAS-33存在相互作用的候选蛋白;通过pull down、免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation,CO-IP）与真核细胞共定位验证Hc-NAS-33与互作蛋白之间关系。酵母文库筛选发现了 6种可能与Hc-NAS-33存在相互作用的候选蛋白;利用昆虫细胞杆状病毒系统成功表达 GST-Hc-NAS-33 重组蛋白,通过 pull down 验证了 Hc-NAS-33 与 Hc-GPB-1存在相互作用,与免疫共沉淀结果相符,且Hc-NAS-33在HEK 293 T细胞中能与Hc-GPB-1共定位。本研究成功筛选得到Hc-NAS-33的互作蛋白,为后续研究其在捻转血矛线虫蜕皮过程中的功能奠定了基础,有助于更好的了解线虫蜕皮分子机制。5.Hc-NAS-33与Hc-GPB-1参与蜕皮过程的机制研究本研究借助秀丽隐杆线虫表达系统,分析Hc-NAS-33和Hc-GPB-1在线虫中的共定位情况,同时利用RNA干扰技术研究Hc-GPB-1在捻转血矛线虫生长发育过程中发挥的功能。结果表明,在秀丽隐杆线虫中异源表达的Hc-NAS-33和Hc-GPB-1存在部分共定位;Hc-gpb-1沉默后,幼虫同样出现发育迟缓、活动性下降及蜕皮功能障碍等表型,且降低Hc-gpb-1表达水平使得虫体新皮的厚度受到影响,表皮、皮下与肌肉之间的紧密连接出现缝隙,相关基因的qRT-PCR进一步验证了以上结果。本研究发现在蜕皮过程中Hc-NAS-33与Hc-GPB-1均参与了新皮的合成,这为进一步阐明捻转血矛线虫蜕皮机制提供了重要依据,同时也为捻转血矛线虫药物研发提供了新的候选药物靶标。综上所述,本研究扩增得到了 3种捻转血矛线虫HcNASs基因,并对其进行生物信息学分析,明确了其蛋白表达特性。通过转录特性分析和RNA干扰实验对Hc-nas-33进行深入研究,发现该基因参与捻转血矛线虫的蜕皮过程;利用酵母双杂交系统筛选获得6种Hc-NAS-33的候选互作蛋白,并验证了与Hc-GPB-1的互作关系;通过异源表达和RNA干扰对Hc-NAS-33及其互作蛋白Hc-GPB-1在捻转血矛线虫蜕皮过程的发挥的生物学功能进行了研究。上述结果为捻转血矛线虫蜕皮机制研究奠定了基础,同时为捻转血矛线虫病的防治提供了新的思路。