论文部分内容阅读
目的:人体的衰老和老化一直是医学研究的重点内容,养生防衰也是人们最为关注的主题。明确衰老的机制,阐明衰老过程中人体各组织、器官乃至细胞、分子的生理病理改变,有助于解释各类疾病的原理,同时也有利于人类的防病和保健。中医体质学说是中医理论体系中的主要学说之一,以此为切入点剖析衰老的机制,可以进一步完善中医学对衰老的认识。人的体质与衰老具有相关性,偏颇体质更易衰老,其中阴虚质的衰老特征表现最明显。同时肠道菌群对人体衰老的过程有一定影响,并与宿主的相关基因存在共同变化特征。已有研究提示,阴虚质存在肠道微生物失衡,及与细胞衰老经典NF-kB活化途径相关因子mRNA表达异常等现象。《黄帝内经》中记载女性在“五七”至“七七”年龄阶段具有逐渐衰老的特点,这一阶段属于女性的“渐衰期”。而阴虚质女性渐衰期肠道菌群是否参与基因共变化调控尚未证实。本课题基于“体衰相关论”,通过研究阴虚质女性渐衰期的多项血液生化指标以及肠道微生物的情况,揭示阴虚质女性渐衰期特有的生理特点和菌群特征,以此为基础研究宿主NF-κB信号通路相关基因mRNA的表达与肠道内微生物的共变化机制。方法:依据中华中医药学会2009年发布的《中医体质分类与判定》标准进行体质判定,选取年龄35-49周岁阴虚质和平和质女性各30名志愿者,采集血液和粪便样本。血液样本一部分运用生化法进行血液生化指标检测,另一部分使用Trizol试剂分离总RNA,反转录后用预混液将cDNA和引物采用qRT-PCR分析,研究编码TAK1,NFKBIA,CCL4,BCL2A1和IL8的mRNA相对表达水平。粪便采集完成后,提取样本的基因组DNA,使用琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度和浓度,再做PCR处理。以PCR产物的浓度为依据等量混样,后用1×TAE浓度2%的琼脂糖胶电泳纯化PCR产物,剪切回收目标条带,进行相关文库的构建后,开始16S rDNA测序。最后通过对肠道微生物检测定量各组样品中细菌的丰度和转录组mRNA表达量计算之间的皮尔森相关系数,找到它们的相关性,研究菌群与基因之间共变化的关系。结果:1.与平和质组相比,阴虚质组样本的TG、HGB、PDW、MPV、RDW-SD、P-LCR数值均较低,WBC、RDW-CV的数值均较高(P<0.05),其中两组PDW、MPV、RDW-CV、RDW-SD、P-LCR的指标差异具有显著性(P<0.01)。2.在各水平上,与平和质组相比,阴虚质组具有独特的肠道菌群特征,在菌群的相对丰度,多样性,功能注释和代谢通路等多个方面存在差异。而肠道菌群物种相对丰度的差异性是两组肠道菌群各方面差异的物质基础,其中阴虚质组相对丰度较大(P<0.05)的微生物类别分别是:脱硫弧菌科(Desulfovibrionaceae)、不明蓝细菌科(unidentified Cyanobacteria)、互养菌科(Synergistaceae)、甲烷杆菌科(Methanobacteriaceae)、不明弧菌科(unidentified Victivallales)、芽孢杆菌科(Bacillaceae)和优杆菌科(Eubacteriaceae);刺骨鱼菌属(Epulopiscium)、不明蓝细菌属(unidentified Cyanobacteria)、芽孢杆菌属(Cloacibacillus)、甲烷短杆菌属(Methanobrevibacter)、不明弧菌属(unidentified Victivallales)、Sanguibacteroides菌属。阴虚质组相对丰度显著较大(P<0.01)的微生物类别分别是:蓝细菌门(Cyanobacteria)、互养菌门(Synergistetes)和广古菌门(Euryarchaeota);变形菌纲(Deltaproteobacteria)、不明蓝细菌纲(unidentified Cyanobacteria)、互养菌纲(Synergistia)和甲烷杆菌纲(Methanobacteria);脱硫弧菌目(Desulfovibrionales)、不明蓝细菌目(unidentified Cyanobacteria)、互养菌目(Synergistales)、甲烷杆菌目(Methanobacteriales)和根瘤菌目(Rhizobiales);不明根瘤菌科(unidentified Rhizobiales);和草酸杆菌属(Oxalobacter)。阴虚质组相对丰度较小(P<0.05)的微生物类别分别是:弧菌目(Vibrionales);弧菌科(Vibrionaceae);粪芽孢菌属(Coprobacillus),弧菌属(Vibrio)。阴虚质组相对丰度显著较小(P<0.01)的微生物类别分别是:梅迪巴特菌属(Merdibacter)。3.与平和质相比,阴虚质组中NFKBIA、CCL4mRNA表达显著上调,BCL2A1 mRNA显著下调(P<0.05)。同时相关基因的表达与阴虚质组的肠道菌群特征微生物存在较广泛的正相关关系,与平和质组肠道微生物存在负相关关系。结论:本课题以中医理论关于女子“五七”至“七七”的生理特征描述为切入点,将中医理论关于女性“天癸”衰老过程论和中医体质理论相结合,重点研究阴虚质女性“五七”至“七七”渐衰期的生理病理分子生物学特征,综合运用基因遗传学、微生物分子生态学和多变量统计分析方法,将反映先天遗传的基因表达与反映后天获得影响的肠道微生物关联起来,探明阴虚质女性渐衰期肠道菌群和基因共变化的部分调控机制。研究发现阴虚质女性渐衰期与平和质相比,在血液生化指标和肠道菌群方面存在一定差异性。阴虚质这种血液生化指标的特点可能反映了促炎因子在炎性衰老过程中起到的作用,且衰老程度重于平和质。另一方面,与平和质相比,阴虚质肠道菌群的差异性也是阴虚质人群衰老特征较其他体质更明显的原因之一。结合NF-κ B信号通路相关mRNA的表达结果分析,证实了相关基因存在与肠道菌群的共变化机制,同时与平和质相比,这种阴虚质的共变化特点是机体衰老倾向更高的原因之一。