蛋白酶是一类在生理学和商业领域中具有广泛应用价值的酶，其在食品和清洁剂中的应用具有悠久的历史。微生物来源的蛋白酶，由于培养简便，产量丰富，适于工业化生产而得以广泛应用。但一般的蛋白酶热稳定性较差，在应用中易于失活，因此热稳定性蛋白酶的研究和开发具有重要的商业价值。对于热稳定蛋白酶性质和结构的研究已经成为当前蛋白酶研究的热点问题。 嗜热菌是一类在高温、高pH条件下可以很好生长的微生物，其产生的酶类也具有相应的性质，有较好的热稳定性和pH稳定性。嗜热子囊菌光孢变种(Thermoascus aurantiacus var.levisporus)是一种生长上限温度较高的嗜热真菌，能够在45℃～50℃的高温下很好的繁殖生长。从该菌中已分离了多种嗜热酶，其以酪蛋白为诱导物培养可分泌蛋白酶，但未见该菌丝氨酸蛋白酶的报道。 本研究以嗜热子囊菌光孢变种为出发菌株，根据真菌蛋白酶的同源保守序列设计兼并引物，通过RT-PCR、快速扩增cDNA末端及热不对称PCR等方法，克隆了该蛋白酶的编码基因Tapro，全长DNA为2704bp，包含一个由494个氨基酸组成的开放阅读框。该基因cDNA已在GenBank中注册，登录号为EU364816。通过分析，该蛋白酶为丝氨酸蛋白酶枯草杆菌S8家族，含有Asp183/Ser384/His215催化三联体，并具有枯草杆菌蛋白酶家族的两个保守区，这与丝氨酸蛋白酶家族催化活性有关。 Tapro基因和酵母分泌型表达载体pPIC9K双酶切后体外连接，构建酵母重组表达载体pPIC9K/Tapro，将重组表达质粒pPIC9K/Tapro用限制性内切酶XbaI(位于HIS4区内)线性化后，采用电击法转化PichiapastorisGS115酵母感受态细胞，于MD/MM平板上筛选His+Mut+表型的酵母转化子。经过PCR检测及G418抗性筛选得到多拷贝整合子，进行甲醇诱导培养。通过检测各转化子每隔24h的蛋白表达情况来筛选高效表达目的蛋白酶的工程菌株。筛选到表达酶活性最高的菌株GS-TAPRO-18，甲醇诱导7d酶活性达到最高，达178.92U/mL。检测目的蛋白的表达量，并测定表达蛋白酶的酶学性质，该酶可以被丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF抑制，具有广谱的底物适用性。表达蛋白酶Tapro的最适反应温度和pH分别为50℃和8.0，该酶在60℃以下稳定，70℃的保温60min仍具有60％的酶活性；在pH值为6.0～12.0之间保持稳定的酶活性。 酵母工程菌株GS-TAPRO-18能在甲醇的诱导下分泌出具生物活性的蛋白酶，这就预示了表达蛋白酶在工业和生物学领域的广阔应用前景。因此，期望能对该基因进行改造，或进一步优化表达条件，获得真正有工业应用价值的酵母工程菌株。