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猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)、猪伪狂犬病毒(pseudorabies virus,PRV)、猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)和猪细小病毒(porcine parvovirus,PPV)可以引起猪繁殖障碍相关疾病,给养猪业造成了严重的经济损失。这五种病毒感染症状相似且常呈现混合感染,给临床检测造成了很大困难。为了快速准确地检测该五种病毒感染,本研究建立了五重PCR检测方法,并应用于相关临床样品,同时对感染率最高的PCV2进行了ORF2基因遗传变异分析。主要研究内容如下:1.CSFV、PRRSV、PRV、PCV2、PPV多重PCR检测方法的建立根据GenBank中已发表的CSFV、PRRSV、PRV、PCV2、PPV的基因序列,针对CSFV E2、PRRSV Nsp2、PRV gB、PCV2 ORF2和PPV VP2,分别设计了五对特异性引物。通过优化反应条件,建立了同时检测五种病毒的多重PCR方法。该方法特异性良好,且敏感性达到pg级别。临床实验结果显示,多重与单重PCR阳性符合率均在90%及以上。2.多重PCR方法检测样品情况本研究于2014-2015年间,在华东部分地区共采集样品335份,应用建立的多重PCR方法予以检测,结果显示,CSFV、PRRSV、PRV、PCV2、PPV感染阳性率分别为3.58%、40.90%、5.67%、43.58%、13.73%;混合感染PCV2和PRRSV阳性率23.58%;混合感染PCV2和PPV的阳性率为6.87%;值得注意的是,137份PRRSV阳性样品即可检出79份PCV2,两者混合感染率较高。3.PCV2基因型鉴别及ORF2遗传变异分析将得到的146份PCV2阳性样品进行基因型鉴别,同时选取15份扩增ORF2基因序列。分型结果表明,146份PCV2阳性样品中PCV2a型11份(7.53%)、PCV2b型127份(86.99%),两者混合感染率5.48%,说明被测地区PCV2主要为2b基因型,少数为2a基因型。遗传变异分析表明,15株ORF2序列核苷酸同源性为89.9%~99.9%,与参考毒株核苷酸同源性为86.2%~99.7%。编码的Cap蛋白发生了不同程度的氨基酸变异,且不同基因型间存在序列重组或漂移现象。15株序列中有9株属于PCV2b型,4株属于PCV2d型,2株属于PCV2a型,未出现2c和2e基因型。本研究为五种猪繁殖障碍相关疾病的单独和混合感染提供了高效的检测方法,并为华东地区五种疾病的流行病学积累了有益资料,对PCV2的遗传变异分析,可为未来疫苗的研制提供一定的依据。