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目的:研究RA诱导SH-SY5Y细胞向神经元分化过程中DNA拓扑异构酶11α、β(TopoⅡα、β)的表达情况,进一步探讨TopoⅡβ与神经分化的关系。
方法:
1细胞培养:SH-SY5Y细胞用含15％胎牛血清、B27(1:100)、100U/ml青霉素、100U/ml链霉素的RPMI1640培养液,置于37℃,5％CO2、饱和湿度的空气培养箱中常规培养。
2细胞传代:待细胞融合度达到80％～90％1时,用胰蛋白酶/EDTA消化液,37℃消化3～5分钟,制成单细胞悬液,按1×105个细胞/ml分别接种于新的培养瓶中,37℃,5％CO2、饱和湿度的空气培养箱中继续培养。
3细胞同步化处理:①正常对照:传代后24h换正常传代用培养液。培养24h后收细胞。②饥饿疗法:传代后24h换含1％FBS,1％B27的D/F12培养基,培养24h后收细胞。用流式细胞仪检测细胞周期的变化,并用X2检验检测其构成比有无差异。
4最佳RA浓度和最佳诱导条件筛选:诱导分化采用两种不同的诱导培养基:诱导分化培养基1,是在传代培养基中直接加入不同浓度的RA。诱导分化培养基2,是将传代培养基中的FBS去除,将B27含量增大1倍,再加入不同浓度的RA。在两种诱导分化培养基中加入不同浓度RA(1、10、50μmol/L),在不同时间点(1d、2d、3d)用倒置显微镜观察各组形态变化和突起长度的变化。从而筛选出最佳RA浓度和最佳诱导条件,用于下一步实验。
5按照最佳诱导条件,取空白对照组细胞和最佳RA诱导条件诱导后1d、2d的细胞,分别用免疫荧光化学检测NF、MAP2、β-tublin3、TopoⅡα、TopoⅡβ在SH-SY5Y细胞向神经元分化过程中的表达情况。
6结果分析:选取各组细胞,将各组TopoⅡα、TopoⅡβ免疫阳性细胞率,分别进行单因素方差分析。
结果:
1正常培养的SH-SY5Y细胞贴壁生长,胞体呈现不规则的多边形,大部分细胞有多个短突起,胞核大,核仁清晰。
2细胞同步化:流式细胞检测分析显示,SH-SY5Y细胞饥饿处理24h后,反映细胞增殖能力的G2/M％+S％下降了13.23％,经X2检验,处于增殖期的细胞构成比明显少于正常培养组,差异有显著性(P＜0.05)。此时,处于G1期的细胞比例为81.58％,说明有大量细胞达到同步。
3最佳诱导条件筛选:由于诱导分化培养基1里含有15％FBS,所以细胞分化不太同步。诱导分化培养基2里不含FBS,在RA诱导下可向神经元快速同步分化,并且分化程度与RA浓度呈正相关,在RA50μmol/L条件下分化效果最好。所以最佳诱导条件选择诱导分化培养基2+RA50μmol/L。在此最佳诱导条件下,1d细胞突起就很明显;2d时突起进一步延伸、增粗,且交织成网,可见许多具备成熟神经元样形态特征的细胞;3d时成熟神经元样细胞数量无显著变化。说明这一诱导方法可以快速诱导SH-SY5Y细胞向神经元同步分化,在2d时分化基本结束。
4在上述最佳诱导条件下,在空白对照组中,MAP2、β-tubulin3和NF在核周体内均有少量表达。在Rald组,β-tubulin3表达最高,MAP2和NF表达比空白对照组高,但不如β-tubulin3增高明显,说明此时分化的神经元尚未完全成熟,仍处于分化过程中。在RA2d组,β-mbulin3表达降低,MAP2和NF表达明显增高,说明此时分化形成的神经元比较成熟,分化基本结束。
5 TopoⅡα在空白对照组细胞中阳性细胞率27.83％±7.97％,在Rald组,阳性细胞率25.07％±4.43％,在RA2d组,阳性细胞率为15.19％±5.11％。因为饥饿疗法24h和条件培养基2中不含FBS,不利于细胞增殖,所以空白对照组中,SH-SY5Y细胞中TopoⅡα表达不是太高。在分化过程中,TopoⅡα呈逐渐递减趋势,RA2d组与其他两组之间阳性细胞率的差异有显著性(P＜0.01)。
在空白对照组细胞中,TopoⅡβ有较多表达,阳性细胞率为30.98％±9.30％,但是强表达阳性细胞率只有10％。在Rald组,TopoⅡβ阳性细胞率达53.69％±11.86％,在RA2d组,TopoⅡβ阳性细胞率为42.39％±3.03％。在Rald组,细胞正处于分化状态中,TopoⅡβ表达也最高;在RA2d组,神经元逐渐成熟,突起进一步延伸、增粗,TopoⅡβ表达仍维持在较高水平。各组之间TopoⅡβ阳性细胞率的差异有显著性(P＜0.01)。
免疫双标进一步显示,在RA2d组,突起较长的成熟神经元(MAP2免疫阳性细胞)中,TopoⅡβ的表达也较高,二者共表达现象显著。
结论:
1所采用的RA诱导分化方法诱导时间短,效率高,易于操作,值得推广应用。
2在SH-SY5Y细胞向神经元分化过程中,TopoⅡα表达呈逐渐递减趋势。TopoⅡβ表达,在Rald(此时细胞正处于分化状态中)最高,在RA2d(神经元逐渐成熟,突起进一步延伸、增粗)仍维持在较高水平,提示TopoⅡβ在SH-SY5Y细胞向神经元分化过程中发挥了重要作用。免疫双标提示TopoⅡβ可能与分化过程中突起的延伸密切相关。