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脂肪氧合酶(Lipoxygenase,LOX),EC 1.13.11.12,是一类含有非血红素含铁的二氧化物,其能催化至少含有一个cis,cis-1,4-戊二烯体系的多元不饱和脂肪酸的立体特异性过氧化。LOX在食品加工行业、化工行业、医药行业、造纸业等有着巨大的应用前景。目前商品化的LOX主要从大豆提取,但产品批次稳定性差,不利于产品质量控制和规模化应用。研究室前期的工作中,成功实现了P.aeruginosa BBE LOX在大肠杆菌(Escherichia coli Rosetta(DE3))中的胞外表达。本研究拟通过表达抗氧化酶、常压室温等离子(ARTP)诱变及诱导条件优化等策略,提高重组菌发酵产LOX的产量;同时考察了谷氨酰胺转氨酶(TGase)催化交联反应对LOX的热稳定性的影响。主要研究结果如下:1.共表达抗氧化酶提高LOX表达将P.aeruginosa BBE来源的超氧化物歧化酶基因sodB和sodM以及E.coli来源的过氧化氢酶基因katE克隆至pRSFDuet-1,分别得到表达质粒pRSF-sodB,pRSF-sodM和pRSF-katE,将上述表达质粒转化至表达LOX的重组大肠杆菌E.coli Rosetta(DE3)(pET-22b(+)/pre-LOXlox1)(N6),得到菌株N6-B,N6-M和N6-K。在20℃和1mmol·mL-1异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)条件下诱导70 h,N6-B、N6-M和N6-K胞内外LOX总酶活分别为21.6、28.1和7.1 U·m L-1,其中N6-B和N6-M较对照菌株N6(11.8 U·m L-1)提高了83%和138%。同时发现,当IPTG诱导30 h左右时,N6-M中胞内LOX产量已接近平稳,为27.2 U·mL-1,是N6胞内LOX酶活的3.1倍。2.ARTP诱变提高LOX的表达以重组菌N6-M作为出发菌株,对其进行ARTP等离子诱变。通过致死率实验,确定最适诱变时间为30 s,同时结合高通量筛选方法,筛选高产LOX的正向突变株。最终获得一株30 h胞内LOX酶活较对照菌株提高14.7%的突变株E7。但是经过遗传稳定性分析发现,E7只能稳定遗传4代,第4代后LOX产量降低至出发菌株水平,因此E7并不能稳定遗传。3.诱导条件优化提高LOX表达通过正交实验,将IPTG浓度和菌体浓度(OD600)作为考察因子,其中IPTG的浓度为4水平,OD600为3水平,进行试验。在上述结果的条件下,通过单因素实验,从诱导温度方面对重组菌N6-M的诱导条件进行优化。从而确定LOX较优的诱导表达条件为IPTG浓度2 mmol·mL-1、诱导菌体浓度(OD600)为2.5和诱导温度为16℃时,诱导30 h胞内LOX产量为29.2 U·mL-1,较对照菌株提高7.4%。4.TGase催化交联提高LOX热稳定性对纯化后的LOX进行了热稳定性的研究。在50℃下,考察了不同条件下TGase对LOX热稳定性的影响。结果显示TGase对LOX的热稳定性起到了提高的作用,其中添加终酶活为0.13 U·m L-1的TGase,20℃下与LOX样品保温30 min,半衰期提高至7.51 min,与空白对照(半衰期为4.92 min)相比提高了52.6%。