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第一部分20-HETE抑制剂对幼鼠创伤性脑损伤后小胶质细胞激活的影响目的:探讨幼鼠创伤性脑损伤(Traumatic brain injury,TBI)后小胶质细胞的激活特点,以及使用20-HETE抑制剂后对脑内小胶质细胞的影响。方法:选用生后9天的雄性SD大鼠,随机分为Sham组,TBI+Vehicle组,TBI+HET0016组。Sham组仅行开颅和缝合处理。其余两组均使用控制性皮层冲击损伤(Controlled cortical impact,CCI)仪复制创伤性脑损伤模型。TBI+HET0016组在损伤后5分钟及3小时腹腔注射20-HETE抑制剂HET0016溶液(1mg/kg),TBI+Vehicle组在相同时间点腹腔注射同等剂量的45%β-环糊精溶液。在TBI后3天,脑组织不同区域冰冻切片进行Iba-1的DAB染色,观察小胶质细胞的区域分布特点以及创伤性脑损伤后小胶质细胞形态变化。皮层区进行CD68/Iba-1免疫荧光,观察脑损伤后小胶质细胞的激活特点以及HET0016对皮层区小胶质细胞的影响。海马区进行CD68免疫荧光染色,观察小胶质细胞变化情况以及HET0016对海马区小胶质细胞表达的影响。结果:Iba-1免疫组化结果显示不同脑组织区域小胶质细胞表达不同,在皮层区特异性染色的小胶质细胞较多。脑损伤组损伤侧激活的小胶质细胞较对侧增多,呈圆形或柱状。Sham组特异性标记的小胶质细胞表达较少,呈分枝状,较多突起。皮层区CD68/Iba-1免疫荧光显示,与Sham相比较,TBI后CD68/Iba-1表达增加。使用HET0016后,荧光强度减弱。海马区CD68免疫荧光显示,脑损伤后海马区CD68荧光增强,HET0016可以减弱TBI后的荧光强度。结论:小胶质细胞具有区域分布特点,TBI损伤刺激导致小胶质细胞激活,形态发生改变。患侧激活的小胶质细胞多于患侧,可能是损伤侧小胶质细胞发生增殖或对侧小胶质细胞迁移。脑损伤后皮层区及海马区小胶质细胞增多,20-HETE抑制剂HET0016能够明显减少未成熟大脑创伤性脑损伤后激活的小胶质细胞数量。第二部分20-HETE抑制剂对原代小胶质细胞增殖和迁移的影响目的:研究HET0016对大鼠原代小胶质细胞增殖、迁移的影响。方法:体外培养大鼠原代小胶质细胞,分离纯化后进行CD11b免疫荧光鉴定。分为对照(Control)组、HET0016组、LPS组和LPS+HET0016组。Control组用含15%FBS的完全培养基培养,HET0016组加入1μM的HET0016溶液,LPS组加入50ng/m L的LPS稀释液。通过流式细胞术、CCK8法和MTT法检测细胞增殖情况;通过细胞划痕实验检测HET0016对原代小胶质细胞水平迁移能力的影响,通过Transwell实验检测HET0016对与原代小胶质细胞垂直迁移能力的影响;Western blot检测NF-κB信号通路的两种蛋白P50和P65的表达情况;ELISA法检测20-HETE表达情况。结果:原代小胶质细胞通过分离纯化以及CD11b鉴定后,小胶质细胞纯度较高,形态清晰稳定。流式结果表明,HET0016组S期百分最低,且与Control组及LPS组相比有显著性差异。CCK8结果显示,除6h组外,其余时间点HET0016组OD值降低且与Control有显著性差异,LPS组与HET0016组、LPS+HET0016组均有显著性差异,MTT结果显示,HET0016组OD值降低。除6h时组外,HET0016组与Control组及LPS组均有显著性差异。划痕实验结果显示,在0h,成功在正常生长的小胶质细胞中划痕,24h后,观察到细胞向划痕的空白处迁移生长。HET0016组向空白处迁移面积低于Control组,但无统计学意义;LPS组向空白处迁移面积明显增加,与Control组、HET0016相比均有统计学意义。垂直迁移结果显示,HET0016组穿膜细胞数量低于对照组,但无统计学意义;LPS组穿膜细胞数量明显高于Control组以及HET0016组。Western blot结果显示:与Control组比较,HET0016组P50,P65相对表达量减少,但差异不显著;LPS组P50,P65表达量显著升高,LPS组添加HET0016后,蛋白表达量下降,且差异具有统计学意义。ELISA结果显示:与Control组比较,HET0016组OD值明显下降,LPS组OD值升高,且差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:本研究结果表明HET0016抑制小胶质细胞增殖、迁移能力,降低小胶质细胞P50和P65蛋白表达。可能是通过调控NF-κB信号通路发挥作用。