葡萄糖氧化酶在分子氧存在下催化葡萄糖氧化成过氧化氢和葡萄糖酸,反应快速,专一性高,安全无毒,因此被广泛应用于食品加工和保鲜、发酵工业、纺织工业、医学诊断和生物传感器等行业。葡萄糖氧化酶主要来源于黑曲霉和青霉属。目前主要以前者为葡萄糖氧化酶的工业产生菌,而对于后者来源的酶研究较少,后者相对前者具有底物亲和力更高,易于分离,酶活稳定性高的优势,可以降低工业生产过程中分离纯化的成本,提高其定量检测的灵敏度和应用效果。本研究从土壤和发霉腐烂的水果样品中分离纯化得到了一株葡萄糖氧化酶产量较高的菌株,通过对其发酵培养基和发酵条件进行优化,并利用基因工程技术将该酶基因在巴斯德毕赤酵母中进行异源表达,分别对天然酶和重组酶进行分离纯化和酶学性质的研究,为开发一种新型的酶制剂提供理论和实践基础。主要研究结果如下:1.胞外葡萄糖氧化酶产生菌的筛选和鉴定及酶学性质研究。采用Fiedure K.J平板显色法从江苏省420份不同来源的土壤和发霉腐烂的水果样品中筛选得到34株产葡萄糖氧化酶的真菌。通过测定发酵上清液酶活,选定产酶活力最高编号为A4的菌株作为出发菌株。综合18S、ITS、BenA、CO1多重序列同源性分析、系统发育树构建以及形态学分类的结果,鉴定菌株A4为产黄青霉(Penicillium chrysogenum)。采用75%的硫酸铵饱和沉淀和50 kDa的超滤膜过滤,获得电泳纯的葡萄糖氧化酶,比活力为303 U/mg,回收率为30%,纯化2.2倍。通过SDS-PAGE电泳和凝胶柱层析色谱法确定该酶为同型二聚体,其亚基和全酶分子量分别为75kDa、149 kDa。该天然酶对D-甘露糖、D-果糖、L-阿拉伯糖等单糖均无催化活性,对D-半乳糖的催化速率仅为对β-D-葡萄糖的1%,表明该天然酶对β-D葡萄糖的底物专一性较好。该天然酶最适反应温度为35℃,最适反应pH为5.0。酶的热稳定性较好,在50℃保温1 h,酶活仍保持约80%。Fe2+,Fe3+,Cu2+,Mn2+对该酶有强烈的抑制作用;吐温20,SDS和Ca2+对该酶有促进作用。该天然酶对β-D-葡萄糖的Km为1.3 mM,亲和力较高,Vmax 为 7.5 U/mg。2.对P.chrysogenum A4产胞外葡萄糖氧化酶的液体摇瓶发酵条件进行优化。采用单因素试验和L9(33)正交试验对该菌株的培养基组分进行优化,得到优化后的培养基组合为碳源(葡萄糖)10%、有机氮源(麦芽浸粉)0.5%、无机氮源(NaNO3)1.7%。通过单因素试验确定A4的培养条件为接种量1mL、装液量50mL、培养温度30℃、培养时间6 d。在此条件下,酶活力提高到17.2 U/mL,为初始发酵条件下酶活的17.2倍。3.P.chrysogenum A4葡萄糖氧化酶基因在巴斯德毕赤酵母表达系统中的克隆表达。以P.chrysogenum A4基因组为模板,通过PCR扩增和测序得到18815bp的葡萄糖氧化酶基因序列。该基因编码604个氨基酸,预测蛋白的理论分子量为66.3 kDa。与GeneBank上的序列进行Blast比对后,仅与两株菌的葡萄糖氧化酶基因具有同源性,分别为P.chrysogenum JN809249.1 和土曲霉(Aspergillus terreus XP001215424),同源性分别达到99%和75%。与前者编码的氨基酸只有1处差异,为第58位的A(丙氨酸),与后者编码的氛基酸相似度为76.2%。P.chrysogenum A4的葡萄糖氧化酶经预测含有由18个氨基酸残基组成的信号肽,4个潜在的N-糖基化位点(N111,N278,N374,N409)和3个处于保守位点的半胱氨酸残基(C186,C228,C542)。将P.chrysogenum A4葡萄糖氧化酶基因与表达载体pPICZαA连接,构建重组表达载体GODP-pPICZαA后转化毕赤酵母SMD1168,通过对发酵上清液的酶活进行测定得到一株成功重组表达的酵母菌株R2。对重组酵母R2摇瓶发酵条件进行优化,通过单因素试验确定最适的发酵条件为:BMMY培养基pH 6.0,甲醇浓度2%,培养时间5 d。采用80%的硫酸铵饱和沉淀和30 kDa的超滤膜过滤,获得电泳纯的葡萄糖氧化酶,比活力为150.1 U/mg,活性回收率为48%,纯化1.9倍。通过SDS-PAGE电泳确定该重组酶亚基的相对分子质量为75 kDa。与天然酶比较,该重组酶对D-甘露糖具有催化活性,为催化D-葡萄糖活性的4%,表明重组酶对β-D葡萄糖的催化专一性仍较好。该重组酶最适反应温度为50℃,最适反应pH为6.0。重组酶的热稳定性较天然酶有所提高,在50℃保温1 h酶活无下降,而在60℃保温1 h,酶活为初始条件下酶活的16%。Fe2+,Fe3+,Cu2+对该酶有强烈的抑制作用。该酶对β-D-葡萄糖的Km为44.9 mM,亲和力低于天然酶,Vmax为9.8 U/mg,高于天然酶。