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肝素(Heparin,HP)是一种天然抗凝物质,应用于临床已经超过80年,至今发挥着无可替代的重要作用。目前商品化肝素主要包括普通肝素和低分子量肝素,其中普通肝素又称未分级肝素(unfractionatedheparin,UFH),主要从猪小肠黏膜、牛肺等动物脏器中提取得到。UFH经物理分离、化学或酶法部分解聚可得到重均分子量小于8000Da的产物即低分子量肝素(low-molecular-weight heparin,LMWH)。LMWH具有体内半衰期长、生物利用度高,副作用小及使用安全等优点,近年逐渐替代UFH成为首选临床抗凝药物。动物脏器来源的LMWH具有原料来源丰富、价格相对低廉、生产工艺成熟等优点。但是,此类结构复杂的动物源肝素质量控制难度大且存在被污染的可能,临床应用中存在较大的安全隐患。考虑到肝素在临床应用中的重要价值,寻求新的非动物源肝素受到广泛关注。大肠杆菌K5(E.coli K5)等微生物能产生一种特殊的胞外多糖(K5CPS),被认为是未经修饰、重均分子量不同的肝素前体多糖,以其为原料有望制备得到非动物来源的肝素及衍生物。因此,本课题以K5CPS为原料,将肝素酶III的部分解聚作用与化学酶法修饰技术合理组合,建立了具有肝素典型结构特征、并具备显著抗凝活性的低分子量产物的半合成新方法,本方法可以实现高效制备结构均一性好、抗凝活性强的非动物源低分子量肝素(non-animal-sourced LMWH,简称 naLMWH)。本论文的具体内容及结论包括以下几个方面:1.胞外多糖K5CPS和硫酸基供体PAPS的规模化制备采用发酵罐发酵大肠杆菌K5,发酵液上清经过超滤浓缩、低温醇沉得到胞外多糖K5CPS粗品,再通过强阴离子交换柱层析纯化得到纯品,产量约503mg/L。对胞外多糖K5CPS进行表征,发现其结构正确,测得其纯度为95.4%、重均分子量(Mw)为118.1kDa、多分散指数(PDI)为1.298,制备规模能满足进一步的实验需求。建立改进的硫酸基供体PAPS合成方法,将其原有合成工艺与膜分离结合,反应规模扩大10倍,酶的用量仅增加一倍,发现起始溶液中含有少量PAPS有助于反应进行。膜分离得到的酶溶液和流出液可以反复使用,并且得到的PAPS浓缩液中原料和副产物少,不用纯化即可直接使用。改进后的方法不仅降低了酶的用量,提高了 PAPS的产率和产量,而且还减少了纯化步骤,成本大大降低。2.化学酶法半合成低分子量肝素及其体外抗凝活性测定胞外多糖K5CPS经化学法N-脱乙酰化/N-硫酸化修饰,将其N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)残基转化为N-硫酸化葡糖胺(GlcNS)得到NS-K5CPS,反应产率为88.4%;表征发现,其双糖组成为△U-GlcNAc和△U-GlcNS,且摩尔百分比为4.5%:95.5%,测得其纯度为 93.6%、Mw=29.84kDa、PDI=1.553,结构分析证明其结构正确。NS-K5CPS经肝素酶Ⅲ部分解聚得到LNS-K5CPS,产率为62%;表征发现,其双糖组成未发生变化,测得其纯度为91.7%、Mw=3.276kDa、PDI=1.178,结构分析证明其结构正确。低分子量产物LNS-K5CPS以PAPS为硫酸基供体,通过C-5差向异构化酶(C5-epi)和肝素2-O-硫酸基转移酶(2OST)共同催化修饰,使其葡糖醛酸(GlcA)残基一步转变为2-O-硫酸化艾杜糖醛酸(IdoA2S),得到I2S-LNS-K5CPS,产率为39%;表征发现,其双糖组成为△U-GlcNAc、△U-GlcNS、△U2S-GlcNS,且摩尔百分比分别为 2%、33%、65%,纯度为90.3%,结构分析其结构正确。I2S-LNS-K5CPS以PAPS为硫酸基供体,由肝素6-O-硫酸基转移酶(6OST)催化,使其葡糖胺(GlcNS)残基发生6-O-硫酸化修饰(GlcNS6S)得到6S-I2S-LNS-K5CPS,产率为73%;表征发现,其双糖组成为 △U-GlcNAc、△U-GlcNS、△U-GlcNS6S、△U2S-GlcNS、△U2S-GlcNS6S,且摩尔百分比分别为1%、15%、23%、7%、54%,纯度为92.5%,结构分析其结构正确。最后6S-I2S-LNS-K5CPS以PAPS为硫酸基供体,由肝素3-O-硫酸基转移酶(3OST)催化,使其葡糖胺发生3-O-硫酸化修饰(GlcNS6S3S),得到非动物源低分子量肝素(naLMWH),产率为72%;对其进行表征并与依诺肝素钠比较,naLMWH 双糖组成为 △U-GlcNAc、△U-GlcNS、AU-GlcNS6S、AU2S-GlcNS、△U2S-GlcNS6S,且摩尔百分比分别为1%、18%、21%、8%、52%,依诺肝素钠双糖组成为 △U-GlcNAc、△U-GlcNS、AU-GlcNS6S、△U2S-GlcNS、△U2S-GlcNS6S,且摩尔百分比分别为10%、5%、15%、5%、65%,比较发现两者的双糖种类相同,且主要的双糖均为△U2S-GlcNS6S;naLMWH的重均分子量为4.021kDa、PDI=1.076,其中Mw<8000Da的比例为98.9%,与一般规定的低分子量肝素相符,依诺肝素钠的重均分子量为5.261kDa、PDI=1.073,其中Mw<8000Da的比例为95.3%。HSQC谱图发现naLMWH具有动物源肝素表现抗FXa活性必需的典型结构信息,依诺肝素钠除了肝素的典型结构外,还可观察到较多非必需结构信息,所以制备得到的naLMWH其精细结构更均一。naLMWH通过生色底物法测定体外抗FXa、FIIa活性,抗FXa活性为87.25±1.62 IU/mg,抗FIIa活性为23.02±0.26 IU/mg。本课题制备非动物源低分子量肝素的方法原料来源质量可控、污染风险低,采用的反应条件温和、高效,所得产物易分离,能够制备结构均一性好、抗凝活性强的低分子量肝素。3.化学酶法半合成低分子量肝素的制备工艺优化非动物源低分子量肝素制备方法的酶法C-5差向异构化/2-O-硫酸化修饰存在产率偏低、反应不够理想等问题,所以对其进行优化。本论文主要通过控制K5CPS化学法N-脱乙酰化的时间,制备了 N-脱乙酰化5h、7h、8h、9h和10h的五种NS-K5CPS产物,其N-硫酸化比例分别为90.7%、94.4%、98.3%、99.2%、99.9%;在此基础上,探究了含不同比例-GlcNAc-GlcA-和-GlcNS-GlcA-的产物对肝素酶Ⅲ的部分解聚和对C-5差向异构化/2-O-硫酸化修饰的反应效率,综合确定K5CPS化学法N-脱乙酰化的最佳时间为8h-10h。将酶法C-5差向异构化/2-O-硫酸化修饰反应和6-O-硫酸化修饰反应合并依次进行,取消两个反应之间的纯化步骤,待6-O-硫酸化修饰反应结束后再进行纯化,可直接得到6S-I2S-LNS-K5CPS。两个反应合并后简化了低分子量肝素半合成步骤,节约了成本,为工业化大量生产非动物源低分子量肝素提供了条件。