研究背景及目的:肺癌是我国发病率和死亡率较高的疾病,其中约85%为非小细胞肺癌(non-small cell Lung cancer,NSCLC)。以铂类为基础的联合化疗是目前临床应用最为广泛的化疗方案,然而长期使用铂类药物常出现耳毒性、肾毒性等副作用及耐药反应,严重影响患者的生活质量及治疗效果。最近研究表明,化疗药物的使用可能通过重塑肿瘤微环境中免疫细胞组成、改变肿瘤细胞自身免疫分子如PD-L1的表达等途径抑制肿瘤免疫应答,从而导致肿瘤免疫逃逸。因此,铂类化疗药物是否会通过诱导肺癌肿瘤免疫抑制从而限制自身的抗肿瘤作用,是临床上值得关注的问题。目前铂类药物对于NSCLC细胞PD-L1表达影响的相关研究尚少,其内在的调控机制仍不清楚。本文拟研究卡铂对NSCLC细胞PD-L1表达的影响及其关键调控机制,从而为肿瘤细胞PD-L1表达调控提供新思路,为铂类药物参与肿瘤免疫逃逸提供新证据,并为铂类药物化疗与免疫疗法联用提供支持依据。研究内容和方法:体外培养人源非小细胞肺癌细胞系H292细胞、A549细胞和H1299细胞,采用实时荧光定量PCR、Western blotting、细胞免疫荧光及流式细胞术等技术检测经卡铂刺激后H292、A549和H1299三种细胞系中PD-L1的表达变化,并采用T细胞增殖试验检测其功能意义;采用通路蛋白特异性小分子抑制剂通过RT-PCR、Western blotting等实验分析EGFR、PI3K/AKT及ERK等信号通路在卡铂调控NSCLC细胞PD-L1表达过程中的作用。随后,利用全转录组测序分析技术和基因表达沉默等研究方法,进一步明确卡铂诱导NSCLC细胞PD-L1表达上调过程中的关键调控分子;并采用通路蛋白特异性小分子抑制剂通过Western blotting等实验分析EGFR、PI3K/AKT及ERK等信号通路在卡铂调控NSCLC细胞PVR表达过程中的作用。结果:1.卡铂可显著上调NSCLC细胞PD-L1的表达水平。CCK8实验结果显示,卡铂对H292、A549及H1299细胞的细胞毒性作用具有浓度依赖性。采用不同浓度卡铂处理H292、A549及H1299细胞48h后,检测发现三种细胞中PD-L1的mRNA、膜蛋白及总蛋白表达水平均显著增高,且PD-L1表达水平增高与卡铂浓度呈浓度依赖性。2.卡铂处理后NSCLC细胞可显著抑制T细胞增殖。H292细胞经50μM卡铂刺激48h后继续与T细胞共培养72h,通过流式细胞术检测T细胞的增殖水平。结果显示与卡铂处理组NSCLC细胞共培养的T细胞增殖比例显著低于与对照组NSCLC细胞共培养的T细胞,说明卡铂处理后NSCLC细胞可显著抑制T细胞增殖水平。3.EGFR、PI3K/AKT及ERK等信号通路参与卡铂诱导NSCLC细胞PD-L1蛋白表达。采用卡铂(50μM)分别刺激H292细胞10min、30min、60min及48h后,H292细胞内EGFR、PI3K、ERK磷酸化及总蛋白表达水平均显著增加,此外,AKT磷酸化水平也显著增加,提示卡铂可激活H292细胞EGFR、PI3K/AKT及ERK等信号通路。采用通路蛋白特异性小分子抑制剂抑制上述通路蛋白可显著抑制卡铂诱导的H292细胞PD-L1蛋白表达上调。4.PVR介导卡铂上调NSCLC细胞PD-L1蛋白表达。通过全转录组测序及qRT-PCR验证结果发现PVR在卡铂诱导PD-L1表达上调过程中起着关键作用。Western blotting结果显示,卡铂可同步显著增加PVR及PD-L1蛋白表达。采用EGFR、PI3K/AKT及ERK等信号通路抑制剂抑制上述通路发现,卡铂可能通过激活PI3K/AKT信号通路,促进PVR的表达,从而进一步上调PD-L1表达。功能实验结果表明,干扰PVR后可显著逆转卡铂诱导的NSCLC细胞对T细胞增殖的抑制作用。结论:卡铂可促进非小细胞肺癌细胞PD-L1的表达,从而抑制T细胞的增殖功能。本研究显示PVR是卡铂诱导PD-L1上调过程的关键分子,机制上我们发现卡铂通过PI3K/AKT信号轴上调PVR进而促进PD-L1的表达。