论文部分内容阅读
目的：通过不同浓度的阿仑膦酸钠（Alendronate，ALN）与相同浓度的常规成骨诱导剂（10-8mol/L地塞米松,10.0mmol/Lβ-甘油酸钠，50mg/L抗坏血酸）作用于大鼠骨髓基质干细胞（Bone Marrow StromalStem Cells, BMSCs），研究ALN是否具有增强常规诱导剂诱导大鼠骨髓基质干细胞向成骨细胞转化的作用，同时研究在何种浓度下增强效应最理想，以此来探讨作为在骨组织工程中的种子细胞来源之一的BMSCs如何在体外能高效的分化为成骨细胞，并观察其成骨过程中BMP-2的表达，为以后临床修复研究提供基础性准备。方法：取2只2月龄的雄性SD大鼠，将其脱颈处死消毒后在超净工作台内解剖出四肢的股骨、胫骨并获其骨髓，采用密度梯度离心法并结合贴壁培养法分离纯化大鼠BMSCs，制备出BMSCs的单细胞悬液。接种于含10%胎牛血清的L-DMEM培养基中，通过连续传代培养，进一步去除未贴壁的干细胞及其他细胞等，待细胞贴壁达到培养瓶底80%左右时，加入0.25%的胰蛋白酶进行消化传代。取生长良好的第3代对数期细胞，以13106/L的细胞浓度进行CD44，CD45表型鉴定以确定所得的细胞为骨髓基质干细胞，同时绘制细胞生长曲线图。将已进行鉴定的细胞以13108/L的细胞浓度分为7个组分别为A-G，A组作为对照组，继续加入含10%FBS的L-DMEM培养基进行培养；B组加入含有常规诱导剂的培养基（10-8mol/L地塞米松,10.0mmol/Lβ-甘油酸钠，50mg/L抗坏血酸）进行培养；C组中加入含常规诱导剂及10-6mol/L ALN的培养基;D、E、F、G组分别在C组的基础上将ALN的浓度分别改为10-7mol/L、10-8mol/L、10-9mol/L、10-10mol/L并加入，以上组均持续培养，每2-3天更换一次培养液，同时在倒置显微镜下观察细胞的增殖及形态变化，培养1、2、3周后分别用western-blot法检测细胞中BMP-2的表达并用t检验进行统计分析。结果：用梯度离心法结合贴壁法进行培养可以获得高纯度的大鼠骨髓基质干细胞。细胞在接种后48h出现贴壁，其形态出现多样性如椭圆形、多角形以及短梭形；约72h后细胞则出现散在的纺锤状并贴壁生长，10-14天后形成增殖。BMSCs贴壁早期排列较为疏松、紊乱，约3周后贴壁细胞变得致密。经传代培养后细胞得到进一步纯化，其形态为均一的长梭形并呈漩涡状排列，而且生长速率加快。生长曲线显示：培养第4d起细胞呈对数生长，约第7d达到高峰，之后转为平台期。流式细胞仪检测CD44阳性表达率93.9%， CD45阳性表达率为5.5%。在加入不同浓度的单一或混合诱导剂后每周观察发现各组细胞存活良好且E组中细胞变得肥大、多角，且周围分泌物较其他组明显增多，A组中细胞发生变化的数量最少，分泌物明显最低，3个不同时期采用western-blot检测发现BMP-2表达量顺序均如下：E>D>F>C>G>B>A。结论：本实验结果表明：1.采用梯度离心法结合贴壁培养法可以获得纯化的大鼠骨髓基质干细胞。2.ALN与常规诱导剂共同作用时对大鼠骨髓基质干细胞无毒性作用。3.在同一浓度的常规成骨诱导剂中加入ALN的浓度为10-8mol/L时对细胞的成骨诱导作用最强。