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研究背景:雌激素缺乏引起的骨质疏松症是影响老年妇女生活质量的一大难题。绝经后骨质疏松常导致牙槽骨吸收加快,牙周组织的再生与修复困难,从而影响牙齿的存留、牙槽骨缺损的愈合等。前期研究证实,去卵巢/去势大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells;BMSCs)功能异常,成骨分化能力下降,而这种异常可能是导致骨质疏松时牙槽骨缺损难以愈合的重要原因。因此,恢复和改善去势大鼠BMSCs的骨向分化能力,是促进牙周组织骨再生和修复的关键。研究发现,periostin(Postn)是维持牙周组织结构和功能完整最为重要的细胞外基质蛋白之一。敲除Postn基因的小鼠可出现骨质疏松和牙周病损等症状。这些直接或间接证实了Postn在调节全身骨代谢和维持牙周局部微环境的稳定中可能发挥了关键性作用。然而,Postn与骨质疏松大鼠BMSCs的功能异常以及与骨缺损修复的关系仍未被研究。此外,由于受损组织的炎症状态,通常情况下很难为移植的干细胞或干细胞聚合体提供健康的生长微环境。而且,因自身聚合能力的限制、中心营养供应等问题,细胞聚合体(细胞膜片)中心细胞往往会出现凋亡、坏死等。自组装多肽材料(RADA16)是近年出现的新型支架材料,因其性能稳定、生物相容性良好以及可提供纳米级三维环境等优点备受关注。但是,目前未见将自组装多肽支架材料和细胞膜片结合,从而为细胞聚合体提供良好的三维微环境和机械支撑的报道。因此,本实验拟探究Postn与骨质疏松大鼠BMSCs成骨分化的关系,希望通过恢复骨质疏松大鼠BMSCs的功能并利用RADA 16支架材料为移植的BMSCs提供良好的微环境,促进去势大鼠牙槽骨缺损的修复和再生,从而为绝经后骨质疏松症患者牙槽骨缺损的干细胞移植治疗提供新的思路和治疗策略。研究目的:探究Postn与去势大鼠BMSCs成骨分化能力的关系;借助携带Postn基因的慢病毒转染去势大鼠BMSCs,观察上调Postn表达对BMSCs生物学行为的影响;构建新型BMSCs膜片-RADA 16组织工程复合体,并在此基础上进行牙槽骨缺损的修复实验。研究内容与方法:1.建立大鼠去势后骨质疏松模型,并用micro-CT进行验证。分离培养正常大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs of sham operation group;SHAM-BMSCs)和去势大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs of ovariectomized group;OVX-BMSCs),通过流式细胞仪鉴定细胞表面特异性集簇、诱导成骨和成脂肪分化来鉴定BMSCs。2.比较SHAM-BMSCs和OVX-BMSCs内Postn的表达水平。继而,将携带Postn基因的慢病毒转入去势大鼠BMSCs内,上调Postn的表达。通过成骨诱导分化后进行茜素红和碱性磷酸酶的染色、Real-Time PCR和Western Blot等实验,探究上调Postn后对OVX-BMSCs的影响。3.构建BMSCs膜片,并培养RADA 16自组装多肽支架,在此基础上构建BMSCs-RADA 16复合体。通过扫描电镜和激光共聚焦显微镜观察BMSCs-RADA 16复合体是否构建成功;通过CCK8观察复合体细胞的增殖情况。4.建立骨质疏松牙槽骨缺损动物模型,在缺损处分别植入OVX-BMSCs细胞膜片/支架、Postn-OVX-BMSCs细胞膜片/支架或仅植入支架材料。3周、6周后对骨缺损区进行micro-CT扫描;6周后进行HE染色和Masson染色探究Postn对骨质疏松大鼠牙槽骨缺损的修复效果。实验结果:1.摘除SD大鼠的双侧卵巢,并在术后3个月对大鼠股骨进行micro-CT扫描和三维重建。与SHAM组相比,OVX组股骨的密度降低。OVX组骨小梁厚度、骨小梁数目和骨体积分数等指标比SHAM组显著降低,而骨小梁间距显著增加,说明OVX组大鼠发生了严重的骨质疏松。2.流式细胞仪结果显示:细胞表面阳性表达骨髓干细胞表面标志物CD29和CD90;同时细胞阴性表达造血干细胞表面标志物CD34和CD45。碱性磷酸酶、茜素红以及油红O染色显示:SHAM-BMSCs和OVX-BMSCs均可向成骨和成脂方向分化;且OVX-BMSCs的成骨分化能力降低,成脂分化能力增强。3.(1)PCR和Western Blot结果显示OVX-BMSCs内Postn的表达量比SHAM-BMSCs明显降低(p<0.05)。(2)用携带Postn的重组逆转录病毒转染OVX-BMSCs后,CCK8实验显示Postn-OVX-BMSCs的增殖能力增强。用碱性磷酸酶、茜素红染色显示Postn-OVX-BMSCs的成骨能力较OVX-BMSCs增强;用PCR和Western Blot检测相关成骨水平,显示Postn-OVX-BMSCs和OVX-BMSCs相比,前者的成骨正相关分子ALP、Runx2和OCN等mRNA的表达水平整体呈升高趋势,成骨负相关分子Sost的表达水平减少。4.分别培养BMSCs膜片和RADA 16凝胶支架,并用细胞膜片包裹凝胶支架构建BMSCs-RADA 16复合体。扫描电镜观察和激光共聚焦结果显示:膜片与支架材料共培养后,细胞粘附到支架材料上,细胞生长状态良好。CCK8实验显示复合体细胞增殖速度较单纯膜片增快。5.通过构建骨质疏松大鼠牙周缺损模型,并在缺损处分别做处理:放置RADA16支架,OVX-BMSCs膜片/支架和Postn-OVX-BMSCs膜片/支架。micro-CT结果显示:Postn-OVX-BMSCs组愈合速度最快。HE染色结果显示,Postn-OVX-BMSCs组新生牙槽骨中有明显的新生血管及大量的成熟骨细胞产生,而对照组和OVX-BMSCs组中只有少量的骨细胞和血管形成。Masson染色显示,对照组和OVX-BMSCs组有大量未成熟的骨胶原,而Postn-OVX-BMSCs组骨质较为成熟。结论:1.去卵巢骨质疏松大鼠BMSCs的Postn表达减少、成骨分化能力降低。上调OVX-BMSCs内Postn的表达后,成骨分化及增殖能力明显提高。2.细胞膜片可与RADA 16自组装多肽凝胶支架结合并构建形成复合体,支架材料可促进BMSCs的增殖和成骨分化。3.体内实验中,OVX-BMSCs内Postn的过表达能促进骨质疏松大鼠牙槽骨缺损的成骨和血管再生,继而加快了骨缺损的愈合,有利于绝经后骨质疏松大鼠牙槽骨的再生。