近20年来，猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）是目前危害世界养猪业最为严重的病原之一，现有的商品化疫苗仅能提供部分保护力。宿主先天性免疫为抗病毒保护作用的第一道防线，并能介导获得性免疫抵抗病毒感染。然而，有些病毒可以逃逸先天性免疫监视造成持续感染从而可能导致病原流行。PRRSV可以诱导宿主产生先天性免疫，但其机制尚不十分清楚。　　本研究克隆获得猪TLR2、3、7、8和9共5种Toll样受体基因，建立了TaqMan实时定量PCR方法;猪体试验发现PRRSV不同毒力毒株诱导的TLR2、3、7和8基因、TNF-α、IL-1β、IL-6、IFN-γ和IL-10细胞因子表达水平有较大差异;TLR3和TLR7/8配体能有效地提高PRRSV抗原猪体免疫保护效率;Poly(I∶C)通过IFIT3介导MAVS信号通路抑制PRRSV复制;成功构建了TLR3启动子荧光素酶报告质粒，发现PRRSV非结构蛋白中Nsp1和Nsp4能显著抑制猪TLR3启动子活性，从而为丰富了PRRSV免疫机制理论基础，为研究安全有效的新型疫苗提供了新的思路。　　主要研究内容分为以下7个部分:　　1.猪五种Toll样受体基因克隆与序列分析　　利用RT-PCR方法，从杜洛克×（长白×黑猪）二元杂交猪的肺泡巨噬细胞（PAMs）中扩增获得猪TLR2、3、7、8和9基因，分别克隆至pMD18-T载体，基因测序结果为:猪TLR2、3、7、8和9基因长度分别为2358bp、2718bp、3153bp、3087bp和3093bp，分别编码786、906、1051、1029和1031个氨基酸。同源性分析结果显示，它们与GeneBank中猪TLR的相应序列同源性达99％以上，与牛、马、羊和人的同源性较高，与鼠的同源性次之，而与鸡的同源性最低，为猪TLRs在PRRSV感染中的作用研究奠定了基础。　　2.猪五种Toll样受体TaqMan实时RT-PCR检测方法的建立　　根据GenBank中TLR2、3、7、8和9的基因序列，设计并合成各自特异性引物及探针，以含TLRs基因的重组质粒为模板，通过对PCR反应条件的优化，建立实时荧光定量PCR方法。并应用该方法检测PRRSV感染或poly(I∶C)刺激后PAMs中TLRsmRNA的相对水平。结果表明，TLRs基因的Ct值与阳性质粒浓度均呈良好的线性关系，相关系数均大于0.99。该方法具有较高的灵敏性，检测核酸分子DNA的下限为50copies/μL，组内、组间变异系数保持在2.3％以内。Poly(I∶C)刺激36h后，PAMs中TLR3mRNA水平显著升高;PRRSV感染36h后，PAMs中TLR2、3、7、8mRNA水平显著升高。该方法的建立为猪TLRs的定量分析提供有有效工具。　　3.PRRSV不同毒力毒株诱导Toll样受体和细胞因子表达特性的比较　　将24头仔猪平均分成4组，每组6头，分别接种高致病性PRRSV分离株BB0907(HP)，低毒力PRRSV毒株NT0801(LP)，NT0801第70代衍生毒株NT0801-F70(LP-der)和DMEM营养液（对照），隔离饲养观察。攻毒后0、6、9、15天用ELISA方法检测猪血清中TNF-α、IL-1β、IL-6、IFN-γ和IL-10含量;攻毒后15天用Real-timePCR方法检测各组肺脏和脑组织中TLR2、3、7和8基因表达水平，并分离猪肺泡巨噬细胞（PAMs）和猪外周血淋巴细胞(PBMCs)，分别采用TLR2、3、78的配体(LTA、poly(I∶C)、CL097)和PRRSV刺激，检测细胞上清中细胞因子水平。结果为:与LP相比，HP组试验猪产生明显临床症状，而LP-der几乎没有毒力;HP感染猪的血清中IL-1β、IL-6、TNF-α和IFN-γ的水平高于LP或者LP-der组。LP组PAMs经poly(I∶C)或CL097刺激后分泌的TNF-α和IL-1β水平显著高于DMEM营养液对照组，同时，HP组PBMCs经CL097刺激后分泌的TNF-α、IL-1β和IL-6显著高于LP和LP-der组。HP组PBMCs经CL097刺激后分泌的TNF-α、IL-1β、IL-6高于LP和LP-der组，LP组PAMs经poly(I∶C)、CL097刺激后TNF-α和IL-1β的分泌高于DMEM组。该结果表明，与LP和LP-der相比，HP更能诱导TLR3、7、8和TNF-α、IL-1β、IL-6和IFN-γ表达，从而丰富了PRRSV免疫和致病机制理论，并有助于开发更为有效的PRRSV疫苗。　　4.猪Toll样受体配体对PRRSV免疫佐剂作用　　采用PRRSV灭活病毒液(KV)与TLR配体组合后皮下免疫小鼠。结果表明，单独的poly(I∶C)和CL097诱导小鼠IFN-γ和PRRSV特异性抗体水平高于KV组或KV-LTA组。进而，将PRRSV灭活病毒液与poly(I∶C)或CL097混合后免疫仔猪，检测其免疫保护效应。结果为，KV混合poly(I∶C)或CL097后诱导猪体产生的PRRSV特异性抗体和T淋巴细胞增殖水平高于KV组。攻毒后，与KV或对照组相比，KV-poly(I∶C)或-CL097免疫组患猪产生的临床症状较轻、病毒血症更低、肺部的病理损伤更少。表明KV-poly(I∶C)或-CL097能提高抵抗PRRSV的保护力。TLR3和TLR7/8的配体为新PRRSV疫苗的开发提供了候选佐剂。　　5.猪IFIT3重组腺病毒的构建与鉴定　　使用RT-PCR方法从猪肺泡巨噬细胞中扩增出猪的IFIT3基因，成功构建穿梭载体pShuttle-CMV-IFIT3，经PCR、测序鉴定正确。将穿梭载体经PmeⅠ线性化后，在大肠杆菌BJ5183内与腺病毒骨架载体pAdEasy-1进行同源重组，产生重组腺病毒基因组DNA。将重组腺病毒DNA经PacⅠ酶切后线性化后通过脂质体方法转染HEK-293A细胞，在细胞内组装成完整的腺病毒。通过RT-PCR、间接免疫荧光试验(IFA)和Westem-blotting检测到IFIT3的表达，证实重组腺病毒rAd-IFIT3可以正确表达目的蛋白，从而为下一步抗病毒试验打下基础。　　6.Poly(I∶C)通过IFIT3介导MAVS信号通路抑制PRRSV复制　　采用双链RNA类似物poly(I∶C)作为刺激物，在MARC-145细胞上系统地观察IFIT3在PRRSV复制过程中作用，结果显示:双链RNA类似物poly(I∶C)刺激MARC-145细胞可以抑制PRRSV复制，而IFIT3表达量明显增加;过量表达猪IFIT3能显著抑制PRRSV复制，干扰MARC-145细胞中内源性IFIT3的表达，利于PRRSV增殖，且同时破坏了poly(I∶C)介导的抗病毒功能;过量表达猪IFIT3可以显著增加poly(I∶C)诱导的IFN-β启动子活性，相反，干扰MARC-145细胞中内源性IFIT3可以抑制poly(I∶C)诱导的IFN-β启动子活性;Poly(I∶C)能激活MARC-145细胞中IFIT3、TBK1和磷酸化IRF3的表达。此外，尽管poly(I∶C)刺激的MARC-145中IFIT3与PRRSV核衣壳(N)蛋白在细胞浆中存在共定位现象，但是共沉淀结果表明二者之间无相互作用。本研究结果表明，poly(I∶C)通过IFIT3介导MAVS信号通路抑制PRRSV复制，从而为PRRSV新型疫苗和抗病毒药物研究奠定了基础。　　7.PRRSV不同非结构蛋白对猪TLR3启动子活性影响　　根据TLR3ORF基因序列设计两条同向引物（GSP1和GSP2），利用4种限制性内切酶DraⅠ、EcoRⅤ、PvuⅡ和StuⅠ分别消化从PAMs提取的基因组DNA，消化产物与适配子链接产生4种消化的DNA库（DL1、DL2、DL3和DLA），并分别以此为模板，进行基因步移。用特异性引物GSP1与适配子引物AP1进行第1步PCR扩增，然后以第1步PCR产物为模板，用特异性引物GSP2与适配子引物AP2进行第2步PCR扩增。将获得的特异性PCR产物克隆至pGL3-Basic质粒，获得pGL3-TLR3-Luc重组质粒，基因序列测定结果证明该质粒含有的外源基因与TLR3启动子基因序列一致。将pGL3-TLR3-Luc质粒转染MARC-145细胞中经poly(I∶C)刺激后检测荧光素酶活性，证明其具有启动子活性。将PRRSV非结构蛋白基因重组表达质粒分别与pGL3-TLR3-Luc质粒共转染至MARC-145细胞，经LPS刺激后测定荧光素酶活性，发现PRRSVNsp1和Nsp4能显著抑制猪TLR3启动子活性，但其相互作用的分子细节尚需进一步研究。