促分裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinases, MAPK)级联途径是存在于真核生物中的高度保守的信号转导途径之一。典型的MAPK级联途径由三种蛋白激酶组成,即MAPK (MPK)、MAPKK (MKK、MEK)和MAPKKK (MEKK),并通过MAPKKK-MAPKK-MAPK依次磷酸化作用将信号传递放大。MAPK级联途径在植物生长发育及多种逆境响应中起重要作用。本研究从全基因组水平对两种重要蔬菜作物,番茄和黄瓜中的MAPK级联途径基因家族成员进行鉴定,并对它们的分类、保守结构域、基因结构、表达特征等进行了分析。同时利用生物信息学方法分析了MAPK级联途径相关基因家族在植物中的分布及进化关系。为进一步探究MAPK基因在番茄生长发育过程中的功能,在分离番茄雄蕊优势表达基因SIMPK13的基础上,我们进行了亚细胞定位、蛋白质体外原核表达、体外磷酸化活性以及表达特征分析。随后利用RNA干扰(RNAi)技术研究了SlMPK13在番茄营养生长、花器官形态发育及花粉发育中的功能,并利用RNA-seq技术探索了其在花粉发育中的作用机制。主要研究结果如下：(1)利用同源比对和HMMER搜索,在番茄基因组中共鉴定了89个MAPKKKs、5个MAPKKs和1个新的MAPK基因；在黄瓜基因组中共鉴定了59个MAPKKKs、6个MAPKKs和14个MAPKs。多序列比对、保守基序和系统进化分析结果表明,植物MAPK和MAPKK基因家族分为A、B、C、D四个亚组,而MAPKKK基因家族则分为MEKK、RAF和ZIK三个亚组。实时荧光定量PCR (qRT-PCR)分析结果显示,多数番茄和黄瓜MAPK级联途径基因在多个植物器官中普遍表达,且参与多种逆境胁迫和激素的响应过程。(2)进化分析显示,MAPKKK家族的基因数目在不同植物中差异很大；植物MAPKKK家族在藻类植物进化以前就已完成三个亚族的分化；随着进化历程的演变,植物MAPKKK家族主要发生了两次基因数目的迅速扩增,分别发生在藻类植物到苔藓植物以及蕨类植物到开花植物的进化过程中,且植物MAPKKK基因数目的大量扩增主要发生在RAF亚族内。植物MAPKK家族A、B两个亚组的基因起源较早,在藻类植物中就已经存在；而C、D亚组MAPKK基因成员直到开花植物才出现。植物MAPK基因家族的迅速扩增发生在蕨类植物到开花植物的进化过程中,且主要发生在D亚组内；C、D两个亚组MAPK基因起源于藻类植物进化以前,A、B亚组的MAPK基因在苔藓植物中也已出现。(3) QRT-PCR及原位杂交结果表明,SlMPK13在番茄植株的多个器官/组织以及雄蕊的不同发育时期中都有表达,但在开放花的雄蕊中尤其是成熟花粉中优势表达。体外原核表达表明,SlMPK13编码一个大小约为44 kDa的水溶蛋白。将该蛋白与磷酸化的酪氨酸抗体进行Western杂交,结果显示其具有体外磷酸化的活性；亚细胞定位结果显示,SlMPK13定位在细胞膜、细胞质和细胞核中。(4)构建了花椰菜花叶病毒CaMV35S组成型启动子启动的RNA干扰载体p35S::slmpkl3-RNAi,并利用“叶盘法”遗传转化番茄品种’Micro-Tom’。观察转基因后代发现,植株表现出生长矮小、叶片发育畸形、根发育受抑制、花器官异常肥大、雄蕊顶端开裂等多种表现型。以上结果表明,SlMPK13在番茄营养生长与生殖发育过程中的功能具有多效性。(5)为特异地研究SlMPK13在番茄花粉发育中的功能,我们构建了花粉特异启动子LAT52启动的RNAi载体pLAT52::slmpkl3-RNAi。对花粉进行表型观察发现,超过50%的转基因花粉畸形,花粉生活力及萌发率下降,花粉育性显著降低,番茄的座果率以及单果种子数目显著下降。花粉细胞学观察与DAPI染色结果显示,在小孢子发育的双核早期及其以前的几个时期,pLAT52::slmpkl3-RNAi转基因花粉发育正常,营养核及生殖核正常可见。双核大液泡时期以后,花粉细胞膜开始呈现不规则凹陷及破损,液泡数目增多。随着花粉成熟,液泡体积变大,细胞内容物逐渐降解,最终形成皱缩干瘪的花粉粒。(6)利用RNA-seq技术比较了pLAT52::slmpkl3-RNAi转基因与对照雄蕊在不同发育时期转录组基因表达的变化。结果发现,雄蕊发育早期差异表达基因数量极少,而雄蕊发育后期有1077个差异表达基因,其中846个上调表达,231个下调表达。基因本体论(Gene Othology, GO)和生物学代谢途径(pathway)分析显示,大多数差异表达基因参与“碳水化合物代谢”、“细胞元件形成”、“信号传导”、“细胞凋亡”等生物学过程。结合细胞学观察及亚细胞定位结果,我们推测,抑制SIMPK13的表达可能在花粉发育晚期启动了花粉细胞凋亡,使得细胞膜及液泡发育异常,细胞内碳水化合物或脂类代谢异常,从而影响成熟花粉的形成。