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干旱严重影响棉花产量和品质,20世纪80年代以来我国棉花旱情有加重的趋势,每年应旱灾减产的棉花总量达到30%以上。特别在棉花主产区新疆,干旱乃是限制其产量的主要因素。干旱对棉花产量的影响在各种非生物的环境胁迫因子中占首位,仅次于生物胁迫即病虫害所造成的损失。干旱直接影响棉花正常代谢和生长发育;干旱导致棉花细胞脱水,膜系统和酶系统遭到破坏,使细胞功能丧失,最终导致植株的代谢紊乱,进而引起蛋白合成受阻,激素平衡破坏。因此,通过分子生物学手段研究棉花抗旱基因及作用机制,从而提高棉花抗旱能力,培育抗旱品种已成为重要的课题。
本研究以抗旱陆地棉材料中H177为实验材料,通过抗旱抑制消减cDNA文库(SSH)筛选到两个抗旱相关基因的EST,利用RACE及RT-PCR技术克隆了2个陆地棉干旱胁迫相关基因的cDNA全长,命名为GhTrx和GhGR。利用荧光定量PCR技术对两个基因做了抗旱相关性表达分析,并通过GFP对其基因亚细胞定位,拟南芥农杆菌转化技术和基因枪活体转化技术对2个基因功能做了进一步研究分析。
获得陆地棉2个抗旱相关GhTrx和GhGR基因cDNA全长序列。其中GhTrx基因cDNA全长1340bp,它包括5’-UTR191bp,完整开放阅读框864bp,3’-UTR285bp,编码287个氨基酸残基的多肽。GhGR基因cDNA全长1035bp,它包括5’-UTR122bp,完整开放阅读框792bp和3’-UTR121bp,编码263个氨基酸残基的多肽。
生物信息学分析表明,GhTrx基因编码蛋白与杨树、蓖麻、拟南芥的相似性分别为70%、72%和76%,系统发育树结果显示GhTrx与蓖麻中该蛋白的亲缘关系最近,同源结构域预测表明该基因有3个保守结构域,二级结构预测表明,该蛋白是由α-螺旋、β-折叠、转角和无规则卷曲组成。GhGR蛋白与氨基酸序列比对和同源性分析显示该基因与杨树、蓖麻、葡萄同源性最高,分别90%、91%和91%。系统发育树结果显示,GhGR与葡萄中该蛋白的亲缘关系最近。跨膜结构域分析表明,该基因有1个跨膜结构域。
在抗旱材料中H177不同的组织和不同干旱处理时期材料,进行Real-time PCR分析。结果表明,干旱胁迫下,GhTrx和GhGR基因在干旱材料的根、茎和叶中受到诱导表达,且在根和叶中2个基因的表达量高于茎中。由此可推测该基因在干旱胁迫时,根、茎和叶中能进行大量表达以抵抗外界的干旱威胁,但根和叶部该基因的表达对应对干旱逆境胁迫起着关键性的作用,有实验可知GhTrx和GhGR基因可能在提高陆地棉抗旱性上发挥一定作用。
构建GFP-GhTrx和GFP-GhGR植物荧光表达载体,基因枪转化洋葱内表皮细胞,发现GhTrx蛋白定位于洋葱的细胞膜上,GhGR蛋白可能定为在细胞核和细胞膜上。
构建pBI121-GhTrx植物超表达载体,转化野生型拟南芥,获得转GhTrx基因T3拟南芥种子,进行抗旱性分析结果表明,转基因的植株能提高拟南芥的抗旱性,由实验可知陆地棉的GhTrx基因的超量表达能提高拟南芥的抗旱性。
构建pBI121-GhTrx和pBI121-GhGR的植物超表达载体,基因枪活体转化抗旱材料和旱敏感材料,收获转基因T0棉桃78个和种子1128粒。这为以后GhTrx和GhGR基因在棉花中的抗旱性功能分析奠定了基础。