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高丝氨酸脱氢酶(HSD)是天冬氨酸族氨基酸生物合成途径的关键酶,同时也是限速酶。它催化天冬氨酸p-半醛生成高丝氨酸,最终控制合成蛋氨酸、苏氨酸、异亮氨酸和S-腺苷蛋氨酸。微生物中天冬氨酸族氨基酸的生物合成受到严格的调控,为了提高产量,关键酶HSD的催化机制和酶分子改造成为研究的重点之一。本研究在成功克隆来源于北京棒杆菌HSD编码基因的基础上,利用定点突变技术对其进行突变。将突变体在E.coli. BL21(DE3)中进行异源表达,采用镍柱纯化后,测定酶活力并进行酶学性质表征。通过电转化法将构建的含突变基因的穿梭表达质粒转入原菌,研究突变对蛋氨酸产量的影响。结果如下：1. BLAST搜索同源性序列,以与北京棒杆菌AS1.299高丝氨酸脱氢酶同源性达到40%的Thiobacillus denitrificans高丝氨酸脱氢酶的晶体结构为模板,进行同源模建。采用AutoDock Vina进行分子对接确定重要HSD氨基酸残基；并通过同源序列比对分析保守序列,确定K112、L200和D206为重要残基。确定对HSD分别进行K112、L200和D206定点突变,测序确定突变体。2.突变体在E.coli.BL21(DE3)中进行诱导表达,采用超声波破碎制备粗酶液,利用镍柱和SDS-PAGE分别纯化和检测目的蛋白,通过分光光度法检测酶活。动力学研究推测该酶具有别构作用,且n都大于1有正协同效应存在并进一步验证了HSD是别构酶。通过动力学参数显示,相对野生型L200突变体kcat/Km值变大,而Km值变小。表明L200位点参与底物结合,能够改变结合口袋形状和底物亲和力,进而改变酶催化效率。较野生型D206G,除Km减小外其他常数无变化,说明D206位点也在底物结合口袋附近。对于K112位点突变体Kcat/Km值分别为野生型的2.3、1.2和1.1倍,底物亲和力增加,表明K112位于辅助因子结合口袋,影响酶的空间结构从而进一步影响酶催化效率。3.此外对动力学参数变化显著的L200D、L200F和K112V三个突变体,进行了酶学性质表征。其中突变体L200D和L200F的最适反应温度比野生型降低了2℃。其他性质没有显著变化,但通过结果可以看到无论是野生型还是突变型具有良好的热稳定性,同时对金属离子和有机溶剂具有良好的抗性。4.通过电转化法,将构建的含L200D突变的穿梭表达载体pZ-HSDL200D转入北京棒杆菌。对重组的北京棒杆菌进行发酵,L200D突变后蛋氨酸产量提高了4倍左右。