表观遗传调控是指DNA序列不发生改变,基因表达发生了可遗传的改变。DNA甲基化是指甲基被添加到DNA分子上的过程。甲基化可以在不改变DNA序列的情况下改变DNA的活性。植物中DNA甲基化发生在三种不同序列中的胞嘧啶上,包括CG、CHG和CHH。重亚硫酸盐测序法是目前检测甲基化最精确的方法,能够检测基因组中每一个胞嘧啶单核苷酸的甲基化情况,是检测甲基化的“金标准”。小孢子的发生对于植物产生正常雄性生殖细胞是至关重要的。实验室前期研究中发现了一个和花药早期发育相关基因EFD。通过对突变体的分析发现EFD基因参与了小孢子发育过程,早期胼胝质和原外壁形成的调控。说明此基因在拟南芥花粉外壁的发育调控过程中有着十分重要作用。生物信息学分析确定EFD蛋白具有典型甲基化转移酶的结构形式,且具有以DNA为底物的DNA甲基化转移酶特有的结构域。与植物中已知的几种甲基化转移酶比较,发现EFD与de novo甲基化活性的Dnmt3家族的甲基化转移酶亲缘关系最近。体外酶活实验也进一步确认了 EFD具有甲基化转移酶活性。但是对于EFD的作用机制还不是很清楚,本论文旨在研究EFD蛋白的下游基因功能,揭示EFD如何调控下游基因的表达来调控花药发育过程。高等植物有性生殖过程不仅是植物繁衍后代的主要途径,也是产生人类赖以生存粮食的基础。作为参与有性生殖过程的雄性生殖系统,花药及其内部花粉的正常发育对有性生殖的正常进行有着重要的意义。为了这一目的,我们开展了以下实验来寻找下游基因:1.因为我们目的是寻找EFD蛋白的下游基因,甲基化会抑制基因的表达,所以我们着重寻找那些在efd突变体背景下表达水平发生上下调的基因。根据胡俊师姐的芯片数据,我们确定了一个在efd突变体背景下发生明显上调的基因为候选下游基因,并命名为ER3。提取花序RNA定量检测确认其在efdd突变体下发生明显上调,RT-PCR和GUS染色结果显示ER3基因是一个泛表达基因。2.从SALK种子公司购买得到ER3基因的单突变体,基因组鉴定筛选出纯合株系。RT-PCR检测显示ER3基因几乎不表达,为有效突变体。以efdd突变体为母本和er3突变体为父本进行杂交,提取基因组鉴定得到杂合F1代,F1代自交后在F2代中筛选出双纯合突变体。3.efd突变体的表型是花粉败育,前期角果发育不正常,但是在后面会开始恢复育性。那么我们统计er3/efd的角果生长情况,发现它角果恢复育性时期更早,能形成大量可育胚珠,且花药亚历山大染色和花粉体外萌发实验结果显示er3/efd双突变体花粉活力恢复较好。4.为了进一步确定ER3基因是否为EFD蛋白的直接下游基因,我们利用亚硫酸盐特异位点扩增技术(BSP)检测ER3基因启动子区域的甲基化情况。结果显示在efd突变体和野生型背景下ER3基因启动子区域无明显甲基化差异,说明EFD不是直接调控ER3基因表达,可能通过另一个或几个基因调控ER3基因表达。5.利用在花药绒毡层中特异表达的启动子ATA7和A9过表达ER3基因,定量PCR检测ER3基因表达情况,检测是否是成功的过表达转基因植株,观察转基因植株有性生殖过程。