目的炎症性肠病(inflammatory bowel disease,IBD)是一种慢性复发性肠道疾病,病变部位集中在结肠和直肠。该病主要症状为腹痛、腹泻、黏液血便等,病程较长,难以彻底治愈,且该病患者发生癌变的机会比正常人高十几倍,被称为“不是癌症的癌症”,严重影响人们的生命健康。目前该病的病因与发病机制尚不清楚,一般认为是环境、感染等因素诱发遗传易感个体异常的肠道免疫反应,从而引起肠道组织损伤及持续性炎症。近年来大量研究表明,肠道菌群为IBD重要的致病因素,参与疾病的发生发展。特别是肠道菌群的病原相关分子模式,如脂多糖、肽聚糖、鞭毛蛋白等,在IBD的发生发展中扮演重要角色。因IBD发病因素的不确定性及病情的复杂性,目前尚缺乏有效的治疗手段。临床研究显示,传统中医药对于IBD的治疗有独特的疗效,如参苓白术散、白头翁汤、大黄牡丹汤等。大黄牡丹汤(Dahuang Mudan Decoction,DMD)出自张仲景所著《金匮要略》,具泻热祛湿、破瘀消痈之效,是治疗湿热血瘀肠痈的常用方。在现代临床上被广泛应用于治疗溃疡性结肠炎、急性阑尾炎等炎症性疾病。然而,其作用机制尚不清楚。现有研究发现,大黄牡丹汤及其活性成分能调节IBD小鼠肠道菌群。鞭毛蛋白是肠道细菌鞭毛的结构组分,也是重要的病原相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs)之一,被机体 Toll 样受体 5(Toll like receptor 5,TLR5)识别结合,参与MyD88/IRAK/TRAF6依赖的信号通路,最终活化核转录因子NF-κB,促炎细胞因子的基因表达上调,如IL-8、MIP3,从而介导机体促炎反应。研究表明,鞭毛蛋白/TLR5在IBD的发生发展中起重要作用。另发现白芍总苷可影响TLR5/NF-KB信号通路,而芍药苷是白芍总苷中的主要成分,约占90%。芍药苷同时为大黄牡丹汤的重要活性成分,进而推测大黄牡丹汤可能通过调节鞭毛蛋白/TLR5信号通路治疗炎症性肠病。故本研究目的在于从鞭毛蛋白/TLR5/NF-KB信号通路着手,探究大黄牡丹汤的作用机制。方法1.大黄牡丹汤质量控制采用高效液相色谱法,选择葫芦巴碱、苦杏仁苷、芍药苷、丹皮酚、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素及大黄酚的标准品为参照,检测10批次大黄牡丹汤指纹图谱而进行质量控制。2.造模与给药C57BL/6小鼠按随机区组法分为6组,即正常组(control)、模型组(model)、美沙拉秦组(mesalazine)、大黄牡丹汤低剂量组(DL)、大黄牡丹汤中剂量组(DM)、大黄牡丹汤高剂量组(DH)。除正常组给予蒸馏水外,其余各组采用3%葡聚糖硫酸钠(dextran sulfate sodium,DSS)溶液自由饮用7天,诱导C57BL/6小鼠IBD模型,之后7天给予蒸馏水。造模第一天开始以0.2mL/10g灌胃给药,正常组与模型组给予蒸馏水,其余各组给予相应药物,连续给药14天。3.大黄牡丹汤对IBD小鼠的治疗作用每天记录小鼠体重、粪便性状、便血及饮食饮水情况,评分并计算疾病活动指数(disease activity index,DAI),同时通过结肠长度、结肠组织H&E染色及病理学评分、外周血白细胞数目,探讨大黄牡丹汤对DSS诱导的IBD小鼠的治疗作用。4.ELISA检测小鼠血清中鞭毛蛋白抗体含量收集小鼠血清,ELISA试剂盒检测血清中鞭毛蛋白抗体的含量。5.大黄牡丹汤对IBD小鼠鞭毛蛋白/TLR5/NF-KB信号通路的影响免疫组化检测大黄牡丹汤对IBD小鼠结肠组织TLR5的影响;Western blot检测大黄牡丹汤对IBD小鼠结肠组织TLR5、NF-κB p65蛋白表达的影响。6.大黄牡丹汤对HT-29细胞TLR5/NF-KB信号通路的影响CBA检测大黄牡丹汤对鞭毛蛋白刺激HT-29细胞分泌细胞因子的影响;RT-PCR检测大黄牡丹汤对鞭毛蛋白刺激HT-29细胞TLR5 mRNA、p65 mRNA表达的影响;Western blot检测大黄牡丹汤对鞭毛蛋白刺激HT-29细胞TLR5、MyD88、IκB、NF-κB p65蛋白表达的影响。结果1.大黄牡丹汤质量控制采用高效液相色谱法,以葫芦巴碱、苦杏仁苷、芍药苷、丹皮酚、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素及大黄酚的标准品为对照,得到大黄牡丹汤的指纹图谱。经精密度、重复性、稳定性等方法学考察,确定高效液相方法的可行性、稳定性与可靠性。除此之外,相同色谱条件下,检测10批次大黄牡丹汤的指纹图谱。结果显示,各批次指纹图谱的相似度达0.90以上,表明实验用复方成分稳定,为进一步实验奠定基础。2.大黄牡丹汤对炎症性肠病小鼠的治疗作用与正常组相比,模型组小鼠体重下降明显,从第7天开始两者的差异具统计学意义(P<0.01);DAI评分升高(P<0.001);外周血白细胞总数、粒细胞数、血小板数及红细胞分布宽度均增加(P<0.01或P<0.001);结肠红肿、缩短(P<0.001);结肠组织结构不完整、肠上皮及肠腺排列紊乱甚至脱落、溃疡明显、固有层及黏膜下层大量淋巴细胞浸润,同时伴随血管扩张。与模型组相比,大黄牡丹汤各剂量组体重下降程度减弱(P<0.05或P<0.01或P<0.001);DAI评分降低(P<0.001);外周血白细胞数、粒细胞数、血小板数及红细胞分布宽度降低(P<0.05或P<0.01或P<0.001);大黄牡丹汤中浓度与高浓度能缓解结肠缩短(P<0.05);结肠组织结构完整、溃疡减少、淋巴细胞浸润减少。综上所述,表明大黄牡丹汤对IBD小鼠具治疗作用。3.大黄牡丹汤对IBD小鼠鞭毛蛋白/TLR5/NF-KB信号通路的影响与正常组相比,模型组小鼠血清中鞭毛蛋白抗体含量增加(P<0.001);小鼠结肠组织TLR5、NF-κB p65蛋白表达增加(P<0.001)。与模型组相比,美沙拉嗪与大黄牡丹汤各剂量组小鼠血清中鞭毛蛋白抗体含量减少(P<0.05或P<0.01);小鼠小鼠结肠组织TLR5、NF-κB p65蛋白表达减少(P<0.05或P<0.01或P<0.001)。由此可知,大黄牡丹汤可能影响鞭毛蛋白/TLR5/NF-κB信号通路。4.大黄牡丹汤对HT-29细胞TLR5/NF-KB信号通路的影响与对照组相比,鞭毛蛋白诱导HT-29细胞分泌细胞因子增多,其中以IL-8的增加最明显(P<0.001),IL-6、IL-1β与TNF也有不同程度的增多(P<0.05或P<0.01或P<0.001)。同时,大黄牡丹汤干预后能减少IL-8、IL-6、IL-1β及TNF的分泌(P<0.05或P<0.01或P<0.001)。结果显示,鞭毛蛋白诱导HT-29细胞TLR5、MyD88、NF-κB p65蛋白表达增加(P<0.05或P<0.01),IκB表达减少(P<0.001),而大黄牡丹汤干预后TLR5、MyD88、NF-κB p65蛋白表达下降(P<0.05或P<0.01),IκB表达增加(P<0.05 或 P<0.01)。PCR 检测 TLR5mRNA 与 p65mRNA 发现,模型组 TLR5mRNA、p65mRNA水平明显增加,且与正常组相比具统计学意义(P<0.001),美沙拉秦与大黄牡丹汤各组相对降低(P<0.05或P<0.001)。由此表明,大黄牡丹汤的确能影响TLR5/NF-KB信号通路结论1.IBD小鼠血清中鞭毛蛋白抗体含量升高,结肠组织TLR5表达增加;2.大黄牡丹汤对IBD小鼠具治疗作用,且与其调控鞭毛蛋白/TLR5/NF-κB信号通路有关。