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番鸭呼肠孤病毒病是由番鸭呼肠孤病毒(Muscovy duck reovirus,MDRV)感染引起的一种高发病率和致死率的急性传染病,主要危害7-40日龄的水禽,以番鸭为主。该病毒的感染主要影响番鸭的育雏及存活率,感染宿主范围不断扩大,且有呈多致病型发生的趋势,是危害番鸭养殖业的重要传染病之一。番鸭是福建畜牧业的主要产业之一,年孵化番鸭、半番鸭苗达上亿羽,但由于MDRV感染雏番鸭仍未能根除,这对番鸭养殖业造成较大的威胁。因此,开展MDRV致病机制的研究可为有效防控MDRV感染提供理论依据。目前,对于MDRV的致病机制尚有许多未被阐明。有研究表明,MDRV p10.8蛋白具有诱导细胞凋亡功能,但其具体机制仍然不清楚。开展MDRV p10.8蛋白诱导细胞凋亡的机制研究对阐明MDRV致病机制及发现新的防制措施具有重要意义。本研究以雏番鸭和DF-1细胞为感染模型,采用透射电镜、流式细胞术观察MDRV感染和p10.8蛋白转染前后内质网应激状态、细胞凋亡水平,运用荧光定量PCR、免疫印迹(Western blot)、免疫共沉淀(CO-IP)、RNA干扰、内质网应激增强剂和抑制剂等手段对内质网应激、凋亡关键分子的mRNA和蛋白表达水平进行检测分析,明确了 MDRV p10.8蛋白经ERS途径诱导细胞凋亡的分子机制。主要研究内容和结果如下:1.MDRV经内质网应激诱导细胞凋亡。本试验以MDRV-YB株(TCID50=10-5.40)分别感染5日龄雏番鸭和DF-1细胞,收集肝脏和DF-1细胞,透射电镜观察内质网状态,流式细胞术检测细胞凋亡水平,荧光定量PCR检测XBP1、Bip、CHOP和Caspase3的mRNA表达水平,PCR检测活化型XBP1s的表达水平。以终浓度为2μg/ml的TM及TUDCA对细胞进行处理并感染MDRV,分析MDRV激活的内质网应激与细胞凋亡之间的关系。结果表明,MDRV感染雏番鸭24h后,肝细胞内质网直径显著增宽,与对照组极显著差异(p<0.01),MDRV组肝脏细胞凋亡率比对照组显著上升(p<0.01);XBP1、Bip、CHOP、Caspase3 mRNA 表达水平比对照组显著上调(p<0.01);PCR结果表明,攻毒组番鸭肝脏,XBP1s的表达也比对照组显著上调。MDRV感染DF-1细胞24h后,内质网直径显著高于对照组,细胞凋亡水平显著高于对照组,XBP1、Bip、CHOP、Caspase3 mRNA表达水平比对照组显著上调(p<0.01),XBP1s的表达也比对照组显著上调。可见MDRV感染诱导了内质网应激和凋亡。内质网应激激动剂衣霉素(TM)处理DF1细胞后感染 MDRV,结果表明 Bip、XBP1、CHOP、Caspase3 的 mRNA表达水平比单独处理TM和MDRV组都显著上调(p<0.01),且XBP1s的活化水平也显著提高(p<0.01);而内质网应激抑制剂TUDCA处理后的DF1细胞感染MDRV,Bip、XBP1、CHOP、Caspase3的mRNA表达水平均比单独处理TM和MDRV组都显著下调(p<0.01),同时,XBP1s的转录也相应显著性减弱(p<0.01)。可见MDRV感染经内质网应激途径诱导了细胞凋亡。2.p10.8蛋白是MDRV经内质网应激途径诱导细胞凋亡的关键蛋白。本试验应用pCI-flag-p10.8真核质粒转染DF-1细胞24h,电镜观察细胞内质网直径,荧光定量PCR检测XBP1、Bip、CHOP、Caspase3的mRNA表达水平,流式细胞术检测细胞凋亡水平,PCR检测活化型XBP1s的表达水平。以终浓度为2μg/ml的TM及TUDCA对细胞进行处理并转染p10.8,分析p10.8激活的内质网应与细胞凋亡之间的关系。以终浓度为1μg/ml的si-XBP1与p10.8共转染,分析XBP1基因在p10.8诱导内质网应激途径中的重要作用。结果表明,p10.8转染细胞后,内质网肿大,直径扩增,与对照组相比差异极显著(p<0.01),XBP1、Bip、CHOP及Caspase3的mRNA表达水平均显著上调(p<0.01),且XBP1s的活化水平也显著提高(p<0.01),细胞凋亡率可高达15%,与对照组形成极显著差异(p<0.01)。可见,p10.8蛋白可诱导ERS和凋亡。内质网应激激动剂衣霉素(TM)处理DF1后转染p10.8,结果表明Bip、XBP1、CHOP、Caspase3的mRNA表达水平比单独处理TM和p10.8组都显著上调(p<0.01),且XBP1s的活化水平也显著提高(p<0.01),而内质网应激抑制剂TUDCA与p10.8共同作用与细胞时,Bip、XBP1、CHOP、Caspase3的mRNA表达水平均比单独处理TM和p10.8组都显著下调(p<0.01);同时,XBP1s的转录也相应显著性减弱(p<0.01)。可见p10.8是经内质网应激途径诱导了细胞凋亡的关键蛋白。siXBP1与p10.8蛋白共装染后,内质网直径与p10.8组比显著减小(p<0.01),细胞凋亡率也显著降低(p<0.01),Bip、XBP1、CHOP、Caspase3 的表达水平也显著下调(p<0.01),同时,XBP1s的表达也比对照组显著下调(p<0.01)。可见,p10.8蛋白是MDRV经ERS诱导细胞凋亡的关键蛋白。3.p10.8蛋白诱导细胞凋亡的BIP/IRE1XBP1/Caspase3信号通路研究。为进一步探讨p10.8蛋白诱导细胞凋亡的分子机制,本试验运用免疫印迹(Western blot)、免疫共沉淀(CO-IP)、RNA干扰等试验技术对BIP/IRE1XBP1/Caspase3信号通路中的关键蛋白进行了分析。结果表明,p10.8蛋白转DF1细胞24h后,CO-IP检测结果表明,p10.8蛋白诱导了 Bip-IRE1复合物的解离,WB结果表明,Bip,p-IRE1,XBP1s,cleave-Caspase3蛋白的表达比对照组显著性上调。IRE1的抑制剂(4μ8C)作用结果表明,XBP1s,cleave-Caspase3的蛋白表达水平与单独转染p10.8组相比显著性下调。siXBP1与p10.8共转染结果表明,cleave-Caspase3凋亡的表达显著低于p10.8组。可见,p10.8蛋白是通过诱导Bip与IRE1的解离使IRE1自主磷酸化触发内质网应激,并经XBP1蛋白的调节,激活凋亡执行蛋白Caspase3,诱导细胞凋亡。综上所述,p10.8蛋白是MDRV诱导细胞凋亡的关键蛋白,主要通过内质网应激Bip/IRE1/XBP1信号通路,将细胞凋亡信号传导,激活Caspase联级反应,经Caspase3凋亡执行蛋白作用于靶蛋白,促进细胞凋亡。