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体外循环术(Cardiopulmonary bypass,CPB)是由人工装置取代心肺脏器功能,保障心脏直视手术实施过程中全身血液循环的一项生命支持技术,在儿童心脏手术中应用广泛。然而,已有研究表明,CPB可导致心脏手术患儿免疫力低下,术后感染风险升高,但其发病机制不明。本论文拟通过系统性研究CPB手术后模式识别受体(Pattern recognition receptors,PRRs)的表达及信号传导的变化,初步阐明CPB对先天性心脏病(Congenital heart disease,CHD)儿童固有免疫功能的影响,为预防和治疗CHD患儿术后感染提供理论依据。第一部分:CHD儿童CPB后Toll样受体(TLRs)表达及功能的研究目的:探讨CHD儿童CPB后单核细胞表面TLR2和TLR4表达水平及功能的变化。方法:我们收集20例CHD儿童CPB前后不同时间点(术前、术后、术后1d、术后3d、术后7d)的外周血标本:1.通过流式细胞术检测单核细胞表面CD14、TLR2、TLR4的表达水平动态变化。2.采用全血体外刺激的方法,分析革兰氏阴性菌脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)和革兰氏阳性菌脂蛋白(Bacterial lipoprotein,BLP),介导NF-κB P65和MAPK p38、ERK1/2信号通路的活化情况。3.检测炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10 释放的动态变化。结果:1.与术前相比,术后CD14、TLR4和TLR2的表达均明显下调。术后1d,三者的表达都恢复到术前水平。2.术后LPS以及BLP介导NF-κB P65活化明显受到抑制,直至术后7d恢复,ERK1/2的磷酸化水平在术后也明显下降,但术后1d即恢复至术前水平。LPS介导MAPK p38的磷酸化水平在各个时间点均无明显变化。但BLP介导p38信号活化在术后均受到抑制。3.与术前相比,术后LPS介导促炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8表达减少。抗炎症因子IL-10的表达上升。术后BLP介导TNF-α、IL-6、IL-8表达减少,IL-10的表达升高。结论:从TLR的表达、TLR信号通路的活化以及TLR介导的炎症反应三个层次,CPB术后单核细胞表达CD14、TLR4和TLR2均显著降低,TLR4和TLR2介导NF-κB和MAPK信号通路活化受到不同程度抑制,释放促炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8减少,抑炎症因子IL-10增多,表明CHD患儿经TLR4和TLR2信号通路介导的固有免疫应答能力受到抑制。可能导致CHD患儿术后发生细菌感染风险升高。第二部分:CHD儿童CPB后NOD样受体(NLRs)表达及功能的研究目的:探讨CHD儿童CPB后单个核细胞NOD1、NOD2表达水平及功能的变化。方法:收集50例CHD患儿CPB前后不同时间点(术前、术后、术后1d、术后3d、术后7d)外周血标本:1.采用Real-time PCR检测各个时间点NOD1和NOD2的mRNA水平,2.分别用NOD1和NOD2激动剂(Tri-DAP和MDP)刺激CHD患儿外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)12h,ELISA检测上清中TNF-α和IL-6的水平。结果:1.与CPB术前比较,术后1d NOD1的mRNA水平明显下降,术后3d开始恢复,术后7d恢复至术前水平。术后NOD2的mRNA水平低于术前,但差异无统计学意义。2.术后Tri-DAP介导炎症因子IL-6和TNF-α的表达明显降低,术后1 dIL-6恢复,术后3 d TNF-α恢复至术前水平。术后MDP介导TNF-α的表达明显降低,术后1d开始恢复。术后MDP介导IL-6的表达水平也低于术前,但差异无统计学意义。结论:CHD患儿PBMCs中NOD 1在CPB术后不同时间点均显著降低,且NOD 1和NOD2介导促炎症因子IL-6和TNF-α的分泌减少,表明细胞内NOD介导的固有免疫应答也受到抑制,提示CHD患儿术后可能抵御胞内菌感染的能力存在不足。第三部分:CHD儿童CPB后RIG-Ⅰ样受体(RLRs)表达及功能的研究目的:探讨CHD儿童CPB后细胞内RIG-Ⅰ、MDA5表达水平及功能的变化。方法:收集30例CHD患儿CPB前后不同时间点(术前、术后、术后1d、术后3d、术后7d)外周血标本:1.采用Real-time PCR检测CPB各个时间点RIG-Ⅰ和MDA5的mRNA水平:2.分离PBMCs,采用聚肌胞核苷酸Poly(I:C)作为配体刺激RIG-Ⅰ和MDA5。3.Western Blot检测phospho-IRF3、IRF3、NF-κB phospho-p65和p65的表达与活化情况。4.采用ELISA方法检测释放出来的干扰素IFN-α、IFN-γ水平。结果:1.术后1 d、3 d、7 dRIG-Ⅰ的mRNA水平均明显低于术前,术后1 d MDA5的mRNA水平也显著降低,术后3d恢复。2.术后1天(T3)PBMCs中IRF3的磷酸化水平低于术前,炎症因子IFN-α的产生也有降低,差异有统计学意义。而IFN-γ表达水平变化不大。结论:CPB术后不同时间点RIG-Ⅰ、MDA5表达降低,以及RIG-Ⅰ、MDA5介导的IFN-α的产生降低。表明CHD患儿CPB后,RIG-Ⅰ、MDA5介导的细胞固有免疫应答也受到抑制,提示CHD患儿术后抵御病毒感染的能力存在不足,这可能也是导致CHD患儿术后病毒易感性升高的重要原因。