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目的:
本课题以糖尿病胃轻瘫模型大鼠为研究对象,探讨按部选穴针刺对糖尿病胃轻瘫大鼠胃运动的干预效应差异,并从分子生物学、脑功能影像学等角度探讨按部选穴针刺后产生效应差异的物质基础及机制,为按部选穴提供科学依据。
方法:
以糖尿病胃轻瘫模型大鼠为研究对象,根据选穴部位不同,将大鼠分为正常组、模型组、多潘立酮组、中脘组、胃俞组、内关组、足三里组进行实验,从胃运动的角度,采用SPECT/CT记录评价不同腧穴对糖尿病胃轻瘫模型大鼠胃运动的效应差异;从系统形态学、分子生物学、PET正电子发射断层扫描技术,观察按部选穴针刺对DGP模型大鼠ICCs超微结构、SCF/c-kit信号通路相关蛋白、以及对不同脑区葡萄糖代谢的影响。
结果:
1.血糖及胃排空结果:与模型组相比,多潘立酮组及4个针灸组均有显著性差异(P<0.05,P<0.01,P<0.001),组间比较无差异(P>0.05)。胃排空检测中在第30min,模型组与正常组相比有显著性差异(P<0.01);第40min和第50min,模型组与正常组相比有显著性差异(P<0.001),足三里组和模型组相比有显著性差异(P<0.05,P<0.01);第60min,模型组与正常组相比有显著性差异(P<0.001),多潘立酮组、内关组及足三里组与模型组相比有显著性差异(P<0.05,P<0.01)。
2.胃窦部病理形态结果:模型组较正常组而言,胃窦部肌层平滑肌细胞胞浆染色淡,透亮,有空泡样变;胃窦黏膜层和黏膜下层黏膜腺体细胞排列不整齐,细胞间间隙变大,主细胞数量减少,壁细胞胞浆减少,空泡样变,染色淡,可见血管扩张。多潘立酮组及4个针灸组与模型组相比,显示出胃窦部肌层平滑肌细胞排列相对致密;黏膜层和黏膜下层的黏膜腺体细胞排列相对整齐,主细胞数量相对有所增加,细胞间隙减小,空泡减少,充血减轻。
3.胃窦部ICCs超微结构结果:模型组较正常组而言,大鼠胃窦部的ICCs数量较正常组明显减少,且体积有所减少,细胞形态结构不正常。细胞内胞质广泛溶解,出现大量空泡,细胞器减少;线粒体大量减少,出现肿胀甚至空泡化;细胞核内核仁崩解,异染色质边缘化;细胞间连接也有部分破坏。与邻近细胞和周围神经纤维末梢的连接松散,网状结构有不同程度的破坏。多潘立酮组及4个针灸组与模型组相比,大鼠胃窦部的ICCs数量有所增多。细胞形态部分不正常。细胞内存在自噬小体和次级溶酶体;胞质内线粒体丰富,形态基本正常,但部分出现嵴的排列不正常以及肿胀;细胞核内异染色丰富。与邻近细胞和周围神经纤维末梢的连接仍有不同程度的松散,但较模型组有所改善。总体实验组中多潘立酮组形态稍好,其余四个针灸组大致相同,均较模型组好但依然存在大量不正常。
4.SCF/c-kit信号通路:
(1)胃窦部SCF免疫组化结果:模型组较正常组表达减少,与模型组比较,多潘立酮组、中脘组、胃俞组、内关组、足三里组表达均有不同程度的增加。
(2)胃窦部c-kit免疫组化结果:模型组较正常组表达减少,与模型组比较,多潘立酮组、足三里组、中脘组、内关组、胃俞组表达均有不同程度的增加。
(3)RT-PCR结果:与正常组相比,模型组大鼠的胃窦中SCF、c-kitmRNA含量较正常组均减少,且差异具有统计学意义(P<0.001);与模型组相比,多潘立酮组及4个针刺组中SCF mRNA含量均有所增高,只有胃俞组、内关组、足三里组较模型组的增高有统计学差异(P<0.01,P<0.001);与模型组相比,多潘立酮组及4个针刺组中c-kitmRNA含量均有所增高,只有多潘立酮组较模型组的增高有统计学差异(P<0.05)。
(4)ELISA结果:模型组血清SCF含量较正常组有明显降低,且差异具有显著性差异(P<0.001),多潘立酮组和4个针刺组血清SCF含量较模型组均有不同程度的升高,但变化规律不同,且仅有多潘立酮组与模型组相比有显著性差异(P<0.05)。模型组血清c-kit含量较正常组明显降低(P<0.01),内关组和胃俞组血清c-kit含量较模型组明显升高(P<0.05),其余各组血清c-kit含量与模型组比较均有升高,但无显著性差异(P>0.05)。
5.血清脑肠肽结果:模型组血清CCK含量较正常组明显升高(P<0.05),内关组和足三里组血清CCK含量较模型组明显降低(P<0.05,P<0.01),其余各组血清CCK含量与模型组比较均有升高,但无显著性差异(P>0.05)。模型组血清GAS含量较正常组明显降低(P<0.05),其余各组血清GAS含量与模型组比较均有升高,但无显著性差异(P>0.05)。模型组血清Ghrelin含量较正常组明显降低(P<0.001),其余各组血清Ghrelin含量与模型组比较均有升高,但无显著性差异(P>0.05)。模型组血清MTL含量较正常组有所下降,其余各组血清MTL含量与模型组比较均有升高,但无显著性差异(P>0.05)。
6.PET/CT结果:
(1)模型组与正常组相比,正激活脑区主要集中在下丘脑结节区、脑桥基底部、中脑被盖、中隔区、下丘脑视前区、嗅球、纹状体、视上区、视皮层、嗅结节、脑桥被盖、伏隔核、中脑黑质、延髓、乳头区、终纹床核、大脑脚、眶皮质、丘脑中线核群、第三脑室顶盖细带、丘脑内侧核群、被膜、杏仁核体、胼胝体、背侧大脑脚皮质、前连合、海马、红核、梨状皮质、丘脑外侧核群、齿状回、压后皮质、下边缘皮质、嗅束、嗅皮质、前核群、血管、大脑中动脉、丘脑底核。负激活脑区主要集中在听觉皮层、感觉皮层、嗅觉皮层、颞叶联合皮质、小脑后叶、顶叶皮质后区、小脑核、小脑前叶、岛叶皮质。
(2)多潘立酮组能够降低模型组葡萄糖代谢升高的脑区为丘脑外侧核群、纹状体、眶皮质、嗅球、嗅结节、被膜、梨状皮质、前核群、终纹床核、前连合;多潘立酮组能够升高模型组葡萄糖代谢降低的脑区为小脑后叶、小脑核、小脑前叶。
(3)中脘组能够降低模型组葡萄糖代谢升高的脑区为延髓、胼胝体、脑桥被盖、纹状体、脑桥基底部、中脑被盖、丘脑内侧核群、中隔区、眶皮质、下丘脑结节区、杏仁核体、视上区;中脘组能够升高模型组葡萄糖代谢降低的脑区为嗅觉皮层。
(4)胃俞组能够降低模型组葡萄糖代谢升高的脑区为胼胝体、纹状体、眶皮质、第三脑室、海马、齿状回;胃俞组能够升高模型组葡萄糖代谢降低的脑区为嗅觉皮层、颞叶联合皮质、感觉皮层。
(5)内关组能够降低模型组葡萄糖代谢升高的脑区为眶皮质、纹状体、胼胝体、第三脑室、海马、中隔区。
(6)足三里组能够降低模型组葡萄糖代谢升高的脑区为胼胝体、海马、纹状体、延髓、视觉皮层、第三脑室、齿状回、脑桥被盖、中隔区、丘脑内侧核群、被膜、杏仁核体、下丘脑结节区;足三里组能够升高模型组葡萄糖代谢降低的脑区为嗅觉皮层、小脑前叶、听觉皮层、颞叶联合皮质。
结论:
1.按部选穴针刺均能调整糖尿病胃轻瘫高血糖状态,有一定的降糖作用,且对胃排空的作用不同,其中远端取穴足三里和内关对胃排空的促进作用明显,局部取穴中脘与胃俞作用不明显。
2.按部选穴针刺对糖尿病胃轻瘫大鼠胃窦部病理形态有一定的改善作用,但远端取穴与局部取穴作用差异不明显。
3.按部选穴针刺对糖尿病胃轻瘫大鼠胃窦ICCs超微结构有一定的改善作用,但远端取穴与局部取穴作用差异不明显。
4.按部选穴针刺能够提高糖尿病胃轻瘫大鼠SCF/c-kit信号通路相关蛋白含量,起到促进胃运动的作用,但远端取穴与局部取穴作用差异不明显。
5.按部选穴针刺能够调整糖尿病胃轻瘫大鼠血清脑肠肽含量,就CCK分泌而言,远端取穴足三里和内关对CCK分泌抑制作用更强,局部取穴中脘与胃俞作用不明显;另外远端取穴与局部取穴对Ghrelin分泌也有不同,远端取穴的促进作用更强。
6.按部选穴针刺对糖尿病胃轻瘫大鼠不同脑区葡萄糖代谢中,可以观察到按部选穴针刺不同穴位在干预脑区上存在很大的差别,对模型组葡萄糖代谢降低的脑区有升高作用的区域大多集中在额叶皮质区,对模型组葡萄糖代谢升高的脑区有降低作用的主要集中于大脑边缘系统。
7.按部选穴针刺对糖尿病胃轻瘫大鼠胃运动存在效应差异,其中远端取穴对胃运动促进作用更明显,产生效应差异的机制可能是通过对脑区的不同刺激,通过脑肠轴途径作用到胃肠道,调节各类胃运动相关脑肠肽含量,从而起到对胃运动的不同调节作用。
本课题以糖尿病胃轻瘫模型大鼠为研究对象,探讨按部选穴针刺对糖尿病胃轻瘫大鼠胃运动的干预效应差异,并从分子生物学、脑功能影像学等角度探讨按部选穴针刺后产生效应差异的物质基础及机制,为按部选穴提供科学依据。
方法:
以糖尿病胃轻瘫模型大鼠为研究对象,根据选穴部位不同,将大鼠分为正常组、模型组、多潘立酮组、中脘组、胃俞组、内关组、足三里组进行实验,从胃运动的角度,采用SPECT/CT记录评价不同腧穴对糖尿病胃轻瘫模型大鼠胃运动的效应差异;从系统形态学、分子生物学、PET正电子发射断层扫描技术,观察按部选穴针刺对DGP模型大鼠ICCs超微结构、SCF/c-kit信号通路相关蛋白、以及对不同脑区葡萄糖代谢的影响。
结果:
1.血糖及胃排空结果:与模型组相比,多潘立酮组及4个针灸组均有显著性差异(P<0.05,P<0.01,P<0.001),组间比较无差异(P>0.05)。胃排空检测中在第30min,模型组与正常组相比有显著性差异(P<0.01);第40min和第50min,模型组与正常组相比有显著性差异(P<0.001),足三里组和模型组相比有显著性差异(P<0.05,P<0.01);第60min,模型组与正常组相比有显著性差异(P<0.001),多潘立酮组、内关组及足三里组与模型组相比有显著性差异(P<0.05,P<0.01)。
2.胃窦部病理形态结果:模型组较正常组而言,胃窦部肌层平滑肌细胞胞浆染色淡,透亮,有空泡样变;胃窦黏膜层和黏膜下层黏膜腺体细胞排列不整齐,细胞间间隙变大,主细胞数量减少,壁细胞胞浆减少,空泡样变,染色淡,可见血管扩张。多潘立酮组及4个针灸组与模型组相比,显示出胃窦部肌层平滑肌细胞排列相对致密;黏膜层和黏膜下层的黏膜腺体细胞排列相对整齐,主细胞数量相对有所增加,细胞间隙减小,空泡减少,充血减轻。
3.胃窦部ICCs超微结构结果:模型组较正常组而言,大鼠胃窦部的ICCs数量较正常组明显减少,且体积有所减少,细胞形态结构不正常。细胞内胞质广泛溶解,出现大量空泡,细胞器减少;线粒体大量减少,出现肿胀甚至空泡化;细胞核内核仁崩解,异染色质边缘化;细胞间连接也有部分破坏。与邻近细胞和周围神经纤维末梢的连接松散,网状结构有不同程度的破坏。多潘立酮组及4个针灸组与模型组相比,大鼠胃窦部的ICCs数量有所增多。细胞形态部分不正常。细胞内存在自噬小体和次级溶酶体;胞质内线粒体丰富,形态基本正常,但部分出现嵴的排列不正常以及肿胀;细胞核内异染色丰富。与邻近细胞和周围神经纤维末梢的连接仍有不同程度的松散,但较模型组有所改善。总体实验组中多潘立酮组形态稍好,其余四个针灸组大致相同,均较模型组好但依然存在大量不正常。
4.SCF/c-kit信号通路:
(1)胃窦部SCF免疫组化结果:模型组较正常组表达减少,与模型组比较,多潘立酮组、中脘组、胃俞组、内关组、足三里组表达均有不同程度的增加。
(2)胃窦部c-kit免疫组化结果:模型组较正常组表达减少,与模型组比较,多潘立酮组、足三里组、中脘组、内关组、胃俞组表达均有不同程度的增加。
(3)RT-PCR结果:与正常组相比,模型组大鼠的胃窦中SCF、c-kitmRNA含量较正常组均减少,且差异具有统计学意义(P<0.001);与模型组相比,多潘立酮组及4个针刺组中SCF mRNA含量均有所增高,只有胃俞组、内关组、足三里组较模型组的增高有统计学差异(P<0.01,P<0.001);与模型组相比,多潘立酮组及4个针刺组中c-kitmRNA含量均有所增高,只有多潘立酮组较模型组的增高有统计学差异(P<0.05)。
(4)ELISA结果:模型组血清SCF含量较正常组有明显降低,且差异具有显著性差异(P<0.001),多潘立酮组和4个针刺组血清SCF含量较模型组均有不同程度的升高,但变化规律不同,且仅有多潘立酮组与模型组相比有显著性差异(P<0.05)。模型组血清c-kit含量较正常组明显降低(P<0.01),内关组和胃俞组血清c-kit含量较模型组明显升高(P<0.05),其余各组血清c-kit含量与模型组比较均有升高,但无显著性差异(P>0.05)。
5.血清脑肠肽结果:模型组血清CCK含量较正常组明显升高(P<0.05),内关组和足三里组血清CCK含量较模型组明显降低(P<0.05,P<0.01),其余各组血清CCK含量与模型组比较均有升高,但无显著性差异(P>0.05)。模型组血清GAS含量较正常组明显降低(P<0.05),其余各组血清GAS含量与模型组比较均有升高,但无显著性差异(P>0.05)。模型组血清Ghrelin含量较正常组明显降低(P<0.001),其余各组血清Ghrelin含量与模型组比较均有升高,但无显著性差异(P>0.05)。模型组血清MTL含量较正常组有所下降,其余各组血清MTL含量与模型组比较均有升高,但无显著性差异(P>0.05)。
6.PET/CT结果:
(1)模型组与正常组相比,正激活脑区主要集中在下丘脑结节区、脑桥基底部、中脑被盖、中隔区、下丘脑视前区、嗅球、纹状体、视上区、视皮层、嗅结节、脑桥被盖、伏隔核、中脑黑质、延髓、乳头区、终纹床核、大脑脚、眶皮质、丘脑中线核群、第三脑室顶盖细带、丘脑内侧核群、被膜、杏仁核体、胼胝体、背侧大脑脚皮质、前连合、海马、红核、梨状皮质、丘脑外侧核群、齿状回、压后皮质、下边缘皮质、嗅束、嗅皮质、前核群、血管、大脑中动脉、丘脑底核。负激活脑区主要集中在听觉皮层、感觉皮层、嗅觉皮层、颞叶联合皮质、小脑后叶、顶叶皮质后区、小脑核、小脑前叶、岛叶皮质。
(2)多潘立酮组能够降低模型组葡萄糖代谢升高的脑区为丘脑外侧核群、纹状体、眶皮质、嗅球、嗅结节、被膜、梨状皮质、前核群、终纹床核、前连合;多潘立酮组能够升高模型组葡萄糖代谢降低的脑区为小脑后叶、小脑核、小脑前叶。
(3)中脘组能够降低模型组葡萄糖代谢升高的脑区为延髓、胼胝体、脑桥被盖、纹状体、脑桥基底部、中脑被盖、丘脑内侧核群、中隔区、眶皮质、下丘脑结节区、杏仁核体、视上区;中脘组能够升高模型组葡萄糖代谢降低的脑区为嗅觉皮层。
(4)胃俞组能够降低模型组葡萄糖代谢升高的脑区为胼胝体、纹状体、眶皮质、第三脑室、海马、齿状回;胃俞组能够升高模型组葡萄糖代谢降低的脑区为嗅觉皮层、颞叶联合皮质、感觉皮层。
(5)内关组能够降低模型组葡萄糖代谢升高的脑区为眶皮质、纹状体、胼胝体、第三脑室、海马、中隔区。
(6)足三里组能够降低模型组葡萄糖代谢升高的脑区为胼胝体、海马、纹状体、延髓、视觉皮层、第三脑室、齿状回、脑桥被盖、中隔区、丘脑内侧核群、被膜、杏仁核体、下丘脑结节区;足三里组能够升高模型组葡萄糖代谢降低的脑区为嗅觉皮层、小脑前叶、听觉皮层、颞叶联合皮质。
结论:
1.按部选穴针刺均能调整糖尿病胃轻瘫高血糖状态,有一定的降糖作用,且对胃排空的作用不同,其中远端取穴足三里和内关对胃排空的促进作用明显,局部取穴中脘与胃俞作用不明显。
2.按部选穴针刺对糖尿病胃轻瘫大鼠胃窦部病理形态有一定的改善作用,但远端取穴与局部取穴作用差异不明显。
3.按部选穴针刺对糖尿病胃轻瘫大鼠胃窦ICCs超微结构有一定的改善作用,但远端取穴与局部取穴作用差异不明显。
4.按部选穴针刺能够提高糖尿病胃轻瘫大鼠SCF/c-kit信号通路相关蛋白含量,起到促进胃运动的作用,但远端取穴与局部取穴作用差异不明显。
5.按部选穴针刺能够调整糖尿病胃轻瘫大鼠血清脑肠肽含量,就CCK分泌而言,远端取穴足三里和内关对CCK分泌抑制作用更强,局部取穴中脘与胃俞作用不明显;另外远端取穴与局部取穴对Ghrelin分泌也有不同,远端取穴的促进作用更强。
6.按部选穴针刺对糖尿病胃轻瘫大鼠不同脑区葡萄糖代谢中,可以观察到按部选穴针刺不同穴位在干预脑区上存在很大的差别,对模型组葡萄糖代谢降低的脑区有升高作用的区域大多集中在额叶皮质区,对模型组葡萄糖代谢升高的脑区有降低作用的主要集中于大脑边缘系统。
7.按部选穴针刺对糖尿病胃轻瘫大鼠胃运动存在效应差异,其中远端取穴对胃运动促进作用更明显,产生效应差异的机制可能是通过对脑区的不同刺激,通过脑肠轴途径作用到胃肠道,调节各类胃运动相关脑肠肽含量,从而起到对胃运动的不同调节作用。