论文部分内容阅读
食品中的病原微生物是危害食品安全的重要影响因素之一。要控制由食源性致病菌引起的食源性疾病,需要对食品中病原微生物进行快速、准确的检测。但传统的细菌检测方法依据生理生化试验和血清型鉴定,一般需要3-5天的时间,耗时长,检测过程繁琐,对特征菌落的判定受主观因素影响较大,通常需要经验丰富的技术人员,无法满足现代对微生物快速检测的需要,因此,建立食品中病原微生物的快速、灵敏、简便、特异性高、高通量的检测方法尤为重要。本论文采用磁性纳米材料,运用现代分子生物学和免疫学原理,对食品中的病原微生物进行快速检测。在聚合酶链式反应(PCR)检测方法中,首先研究了不同粒径和不同修饰功能基团的磁性纳米粒子对于细菌基因组DNA提取结果的影响,并以提取的细菌基因组DNA作为模板,建立沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌的PCR和三重PCR的检测方法,对比了琼脂糖凝胶电泳和变性高效液相(DHPLC)2种检测方法对PCR扩增产物检测结果的不同,结果DHPLC的检测方法在灵敏度和检测时间上都要好于琼脂糖凝胶电泳。并在牛奶样品中应用了三重PCR-DHPLC的方法进行检测,检测限达到102cfu/mL,整个反应在2小时内便可完成。在酶联免疫吸附法(ELISA)检测方法中,以灭活E.coli O157:H7全菌体为免疫原免疫小鼠,通过细胞融合得到10株单克隆抗体,通过筛选配对筛选出双抗夹心ELISA方法的捕获抗体和检测抗体,建立了对E.coli O157:H7具有良好特异性的双抗夹心ELISA检测方法,对于纯培养液的检测标准曲线的线性范围为5×105 cfu/mL到1×10~8 cfu/ mL,检测限为105 cfu/ mL。将单克隆抗体包裹在磁性纳米材料表面制备免疫磁珠,将免疫磁珠的富集作用与双抗夹心ELISA方法结合,只需要6.5小时的检测过程,可以检测出绿茶中1 cfu/mL的E.coli O157:H7,极大地缩短了检测时间,满足快速、灵敏、简便、高通量的检测需要。